Die VersaLive-Plattform ermöglicht mikrofluidische Säugetierzellkulturen für vielseitige Anwendungen

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1034 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Mikrofluidik-basierte Zellkulturen ermöglichen eine präzise räumlich-zeitliche Regulierung der Mikroumgebung, die Bildgebung lebender Zellen und eine bessere Darstellung physiologischer Bedingungen bei gleichzeitiger Minimierung des Reagenzienverbrauchs. Trotz ihrer Nützlichkeit sind die meisten Mikrofluidiksysteme für eine bestimmte Anwendung konzipiert und erfordern in der Regel spezielle Ausrüstung und Fachwissen für ihren Betrieb. All diese Anforderungen verhindern eine breite Verbreitung mikrofluidischer Zellkulturen. Hier haben wir eine vielseitige und benutzerfreundliche Mikrofluidikplattform für Perfusionszellkulturen für mehrere Anwendungen (VersaLive) entworfen und implementiert, für die nur Standardpipetten erforderlich sind. Hier zeigen wir die vielfältigen Einsatzmöglichkeiten von VersaLive (z. B. Zeitraffer-Bildgebung lebender Zellen, Immunfärbung, Zellwiederherstellung, Zelllyse, Plasmidtransfektion) in Säugetierzelllinien und Primärzellen. VersaLive könnte Standard-Zellkulturformate in mehreren Anwendungen ersetzen und so die Kosten senken und die Reproduzierbarkeit in allen Labors erhöhen. Das Layout, die Dokumentation und die Protokolle sind Open Source und online unter https://versalive.tigem.it/ verfügbar.

Systeme im Mikromaßstab können so konzipiert werden, dass sie experimentellen Anforderungen gerecht werden, die in Standard-Säugetierzellkulturen nur schwer oder überhaupt nicht zu erfüllen sind1,2,3. Im Allgemeinen ermöglicht der Einsatz von Mikrofluidik für die Zellkultur eine präzise Kontrolle der extrinsischen Faktoren (z. B. Nährstoffe, Arzneimittelbehandlung, Probeneinschluss) und gleichzeitig eine bessere Nachahmung physiologischer Bedingungen4,5,6,7. Dank der reduzierten Volumina ermöglicht die Mikrofluidik die Minimierung des Verbrauchs teurer Chemikalien. Das höhere Maß an Kontrolle über die Versuchsbedingungen erhöht die Zuverlässigkeit von Protokollen, bei denen das Ergebnis ansonsten stärker von den Fähigkeiten des Bedieners abhängt. In den letzten Jahren hat sich beispielsweise der Einsatz mikrofluidischer Systeme als vielversprechend erwiesen, um eine bessere Krebsdiagnose durch Standardisierung der immunhistochemischen Biomarkeranalyse zu ermöglichen8,9,10. Weitere aktuelle Schlüsselanwendungen der Mikrofluidik in Säugetierzellen sind die Hochdurchsatz-Einzelzellsequenzierung11,12, das parallelisierte Arzneimittelscreening13, die zeitliche Modulation von Behandlungen14 und die automatisierte Rückkopplungssteuerung biologischer Prozesse15.

Mikrofluidische Plattformen sind in der Regel für bestimmte Einzelanwendungen konzipiert (z. B. Zellkultur4, Einzelzell-Transkriptomik11, Immunfärbung fixierter Gewebe9) und beinhalten meist komplexe mehrschichtige Mikrofabrikationsprozesse14,16,17. Kolnik et al. entwickelte eine mikrofluidische Plattform für die Bildgebung lebender Zellen, die in der Lage ist, kultivierte Zellen mit zwei Eingaben und allen ihren Mischverhältnissen dynamisch zu stimulieren14. Diese Plattform erfordert eine mehrschichtige Masterherstellung, verwendet ein komplexes Zellladeprotokoll, erfordert den Einsatz zusätzlicher Ausrüstung (z. B. Schrittmotoren, externe Controller) und lange Verbindungsschläuche, wodurch Totvolumina entstehen, die das tatsächliche Volumen des eigentlichen Mikrofluidikchips überschreiten . Andererseits haben Gagliano et al. nutzten ein einschichtiges und in sich geschlossenes mikrofluidisches Gerät, um die Effizienz des Pluripotenz-Reprogrammierungsprozesses menschlicher Körperzellen zu steigern4. Diese Plattform hat den Vorteil einer einfachen Geometrie und Herstellung, hat aber den Nachteil der einzigen statischen Zellkultur, die die möglichen Anwendungen einschränkt. Sowohl Kolnik et al. und Gagliano et al. Plattformen sind nicht für eine unkomplizierte Gewinnung der kultivierten Zellen optimiert.

In dieser Arbeit haben wir ein vielseitiges mikrofluidisches Gerät entworfen und entwickelt, das wir VersaLive nannten, um die Anwendung mehrerer Protokolle für adhärente Säugetierzellen zu ermöglichen, darunter Zellkultur, Immunfärbung, Bildgebung lebender Zellen und Zellentnahme mithilfe von Standard-Laborpipetten. Um eine breite Akzeptanz von VersaLive zu ermöglichen und die Übertragung standardmäßiger experimenteller Protokolle auf die Mikrofluidik zu vereinfachen, haben wir VersaLive so konzipiert, dass es über einfache Mikrofabrikationsverfahren repliziert werden kann und alle Vorgänge auf dem Chip durch Standardpipettieren durchgeführt werden können. Wir demonstrierten die Kultivierung von Zelllinien und Primärzellen sowie die Anwendung verschiedener Protokolle von der Immunfärbung bis zur Plasmidtransfektion und Zelllyse.

Das Gerät ist in Abb. 1 dargestellt; Es besteht aus einem gasdurchlässigen Elastomer (Polydimethylsiloxan (PDMS)), das mittels Standard-Photolithographie und Soft-Lithographie hergestellt und auf ein Deckglas aus Mikroskopieglas geklebt wird. Das Gerät ist so konzipiert, dass nur ein einziger fotolithografischer Schritt zur Vorbereitung des Wafers erforderlich ist, wodurch eine schnelle und einfache Replikation der Technologie auch in Laboren ohne spezielle Kenntnisse in der Mikrofabrikation ermöglicht wird. Für die Herstellung des PDMS-Chips ist keine Ausrichtung der Schichten erforderlich und der gesamte Herstellungsprozess kann von unerfahrenem Personal in einem Schulungstag erlernt werden. Das zur Herstellung von VersaLive-Chips erforderliche Material ist in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Wie in Abb. 1a dargestellt, besteht die Plattform aus fünf 250 µm breiten Kulturkammern. Die Wahl der Anzahl der auf einem Chip zu platzierenden Kammern wurde durch die geometrischen Einschränkungen der 3 mm breiten Reservoirs bestimmt, die innerhalb eines 30 mm großen kreisförmigen Deckglases angeordnet sein müssen und das Ausschneiden mit einer Biopsie-Stanze ermöglichen müssen. Jede Kammer ist auf einer Seite mit einem gemeinsamen Hauptkanal und auf der anderen Seite mit einem unabhängigen Eingangskanal verbunden. Jeder Eingangskanal besteht aus zwei 150 μm breiten parallelen Kanälen, um die Robustheit gegenüber Verstopfung durch Staubpartikel zu erhöhen. Der Zugang zu den Kanälen erfolgt über Ports (Abb. 1a), die als Reservoirs dienen, in denen Inputs (z. B. Wachstumsmedium, Medikamente, Reagenzien) ausgetauscht werden können. Allein der hydrostatische Druck treibt den Fluss von den Anschlüssen zu den Kammern an, wodurch Pumpen, Motoren oder Druckregler überflüssig werden. Zellfilter sind an einer Seite jeder Kulturkammer eingebettet, um während der Ladephase Zellen in der Kammer zurückzuhalten, indem sie verhindern, dass etwas mit einer Breite von mehr als 5 µm durch den Filter gelangt. Ein Fluidwiderstand mit einer Breite von 20 μm und einer Länge von 6 mm verbindet jede Kulturkammer mit ihren Eingangskanälen. Der geeignete Flüssigkeitswiderstand wurde beim Testen mehrerer Längen desselben Serpentinendesigns gefunden. Der Zweck des Widerstands besteht darin, das Laden der Zellen in die Kammern innerhalb von Sekunden nach dem Füllen des Reservoirs zu ermöglichen und gleichzeitig sicherzustellen, dass während der Perfusion keine Scherspannung auftritt, sobald die Zellen am Objektträger haften.

a Aufbau des Mikrofluidikgeräts mit fünf unabhängigen Kammern. Auf der einen Seite sind alle Kammern mit dem Hauptkanal verbunden, der sich von Anschluss A zu Anschluss B des Schaltplans erstreckt. Flüssigkeiten können über spezielle Anschlüsse (Anschlüsse Nr. 1 bis Nr. 5 in den Schaltplänen) unabhängig zu jeder Kammer geleitet werden. Der schlangenförmige Strömungswiderstand verhindert Scherbelastungen der Zellen während des Gerätebetriebs. b, c Betriebsmodi von VersaLive und ihre Finite-Elemente-Simulationen in der COMSOL Multiphysics-Software (gestrichelter Einschub). Im Single-Input-Modus „Perfusion“ (b) wird der Hauptkanal genutzt, um allen Kammern gleichzeitig das gleiche Medium zuzuführen. Der Multi-Input-Modus (c) nutzt die dedizierten Anschlüsse, um jeder Kammer unterschiedliche Inputs (z. B. Medien, Chemikalien) zuzuführen und so Kreuzkontaminationen zu vermeiden. d Während der Zellbeladung fließt die Zellsuspension durch den Hauptkanal in die Kammern. Sobald sich die Zellen in der Kammer befinden, werden sie langsamer und werden schließlich durch die Filtermerkmale gestoppt, wie im Geschwindigkeitsprofil der Simulation vorhergesagt. Maßstabsbalken, 150 µm. Es wurde beobachtet, dass die Lösungsmittelverdunstung an den Reservoirs die gelöste Konzentration des Kanalinhalts während der Perfusion erhöhte. Der Effekt wurde durch das Anbringen einer Mineralölschicht an den Reservoirs vollständig beseitigt. Im Plot wird ein einziger repräsentativer Lauf gemeldet.

Alle Vorgänge in VersaLive werden durch einfaches Pipettieren von Inhalten in und aus den Anschlüssen ausgeführt, die effektiv als Reservoirs dienen. VersaLive kann auf zwei Arten betrieben werden: im Single-Input-Modus, bei dem derselbe Input (z. B. Zellwachstumsmedium) an alle Zellkammern geliefert wird (Abb. 1b), oder im Multi-Input-Modus, bei dem ein anderer Input erfolgen kann an jede der 5 Kammern abgegeben (Abb. 1c). Der Single-Input-Modus wird eingerichtet, indem ein Volumen von bis zu 20 μL in das mit dem Hauptkanal verbundene Reservoir (Anschluss A in Abb. 1b) pipettiert wird, während alle anderen Reservoirs leer bleiben. Wir bezeichnen diese Konfiguration als „Perfusion“-Einzeleingangsmodus, da ein konstanter Fluss vom gefüllten Reservoir zu den Zellkammern vorhanden ist. Eine Variante des Single-Input-Modus ergibt sich, wenn alle Behälter mit dem gleichen Volumen gefüllt sind. In diesem Fall ist kein Durchfluss im Gerät vorhanden, wodurch eine statische Zellkultur entsteht. Dieser „statische“ Single-Input-Betriebsmodus ist besonders praktisch während der Zelladhäsionsphase, wenn die Zellen noch nicht vollständig am Chip befestigt sind und eine Strömung die Gefahr ihrer Verdrängung mit sich bringt.

Im Multi-Input-Modus werden alle Eingangsreservoirs gefüllt, während die Hauptkanalanschlüsse leer bleiben (Abb. 1c). Diese Konfiguration erzeugt einen aktiven Fluss durch jede Kammer, der stark genug ist, um einen Rückfluss aus dem Hauptkanal zu verhindern, aber ausreichend langsam, um eine Scherbeanspruchung der Zellen zu verhindern (Abb. 2a). Wir haben überprüft, dass ein Volumen von 20 μl pro Kammer für mindestens 24 Stunden konstante Perfusion in einem Zellinkubator ausreicht. Der Multi-Input-Modus ist beispielsweise anwendbar, wenn unterschiedliche Konzentrationen eines kleinen Moleküls oder Antikörpers parallel getestet werden müssen, etwa für das Arzneimittelscreening oder die Immunfärbung.

a CHO-K1-Zellen in den angegebenen Kammern wurden einer Tunicamycin-Behandlung (0,5 μg/ml für 20 Stunden) ausgesetzt und die integrierte Stressreaktion wurde anhand der Intensität der CHOP::GFP-Fluoreszenz gemessen. Die dritte Reihe zeigt Rhodamin B, das während der Zeitrafferaufnahme als Flusstracer verwendet wurde, um den ordnungsgemäßen Fluss in der Plattform zu überprüfen. Maßstabsbalken, 150 µm. b Zeitverlauf der durchschnittlichen CHO::GFP-Fluoreszenz über Zellen in den Kammern Nr. 1, Nr. 2, Nr. 3, Nr. 4 (15-minütige Zeitauflösung). c Die Einzelzellquantifizierung der CHO::GFP-Fluoreszenz der in a berichteten Bilder ergab einen 15-fachen Unterschied zwischen den behandelten und den unbehandelten Proben. Punkte stellen einzelne Zellen dar (n = 38 in Nr. 1, n = 28 in Nr. 2, n = 49 in Nr. 3, n = 55 in Nr. 4, n = 24 in Nr. 5), während schwarze Balken Mittelwerte darstellen.

Die Software COMSOL Multiphysics wurde verwendet, um jeden Betriebsmodus (Methoden) zu simulieren und die resultierenden Geschwindigkeitsprofile zu berechnen, wenn realistische hydrostatische Druckunterschiede über den Chip ausgeübt werden, wie in den gestrichelten Einschüben dargestellt (Abb. 1b, c).

Unabhängig von der gewählten Betriebsart werden die Zellen immer im Single-Input-Modus „Perfusion“ in die Kammern geladen, wie in Abb. 1d dargestellt. Zeitrafferaufnahmen des Zellladeschritts wurden verwendet, um die Zellladegeschwindigkeit von HeLa-Zellen abzuschätzen, die am Eingang der Kammer 150 µm pro Sekunde betrug; Es dauert dann weitere 5 Sekunden, um weitere 150 µm zurückzulegen, bevor es schließlich am Filter anschlägt, entsprechend dem in Simulationen ermittelten und in Abb. 1b, c dargestellten Geschwindigkeitsprofil. Obwohl die Zellen zunächst näher an den Pfosten ausgesät werden, bilden sie anschließend eine gleichmäßige Monoschicht, die schließlich die Oberfläche der Kammer bedeckt. Die anfängliche Anzahl der in die Kammern zu ladenden Zellen kann je nach Zelltyp und experimentellen Anforderungen (z. B. Zellgröße, Dauer des Experiments, Zellabdeckung, Zeitpläne, Notwendigkeit einer Monoschicht, Eigenschaften der Zelllinie) variieren. Die Beladungsrate der Zellen in einer Kammer kann leicht durch Variation der Konzentration der Zellsuspension angepasst werden. Um ein Anhaften der Zellen an anderen Bereichen des Chips als den Kammern (z. B. Hauptkanal, Reservoirs) zu verhindern, ist es jedoch vorzuziehen, die Zellkonzentration so anzupassen, dass die Ladezeit kurz, dh innerhalb weniger Minuten, bleibt. In unseren Experimenten haben wir beobachtet, dass die optimale Zellkonzentration für HeLa-Zellen zwischen 1000 und 5000 Zellen pro Mikroliter liegt, um die Beladung eines ganzen Chips innerhalb weniger Minuten durchzuführen.

Unter Einwirkung der äußeren Umgebung neigt das kleine Volumen der Reservoirs dazu, mit der Zeit zu verdunsten, selbst wenn sie in einem Zellinkubator aufbewahrt werden, wie in Abb. 1e dargestellt. Dieser Effekt kann jedoch durch Pipettieren von 2,5 μl Mineralöl in die Reservoirs beseitigt werden, wie in Abb. 1e dargestellt, wo in Abwesenheit von Öl ein zeitlicher Anstieg der Konzentration gelöster Stoffe im Reservoir beobachtet wurde, in diesem jedoch vollständig aufgehoben wurde Gegenwart.

Wir haben die Fähigkeit der Mikrofluidikplattform validiert, unabhängige chemische Eingaben in jede der fünf Kulturkammern mittels einer CHOP::GFP-markierten CHO-K1-Zelllinie zu liefern18. CHOP ist ein Transkriptionsfaktor, dessen Expression durch die Aktivierung des Integrated Stress Response (ISR)-Signalwegs und durch Stress des endoplasmatischen Retikulums (ER) induziert wird. Die Zellen wurden in die Kammern geladen und über Nacht im Inkubator im statischen Single-Input-Modus in Standard-Wachstumsmedium aufbewahrt, um die Zelladhäsion an der Glasoberfläche sicherzustellen. Am folgenden Tag wurden alle Reservoirs durch Pipettieren geleert und der Chip wurde auf den Multi-Input-Betriebsmodus umgestellt, indem frisches Medium in die mit den Kammern Nr. 2 und Nr. 4 verbundenen Reservoirs gegeben wurde, während Tunicamycin, gelöst in frischem Medium (0,5), hinzugefügt wurde µg/ml) wurde in die Kammern Nr. 1, Nr. 3 und Nr. 5 gegeben, wie in Abb. 2a gezeigt. Tunicamycin ist ein starker Auslöser von ER-Stress, indem es die N-Glykosylierung von Proteinen blockiert und daher die CHOP::GFP-Expression in den Reporterzellen induzieren sollte. Der VersaLive-Chip wurde dann auf ein inverses Fluoreszenzmikroskop gelegt und jede Kammer wurde 20 Stunden lang in 15-Minuten-Intervallen abgebildet. Wie in Abb. 2a – c gezeigt, exprimierten am Ende der Behandlung nur Zellen, die Tunicamycin ausgesetzt waren, CHOP::GFP, was bestätigt, dass es keinen Querfluss zwischen den Kammern gab. Darüber hinaus haben wir als zusätzliche Überprüfung der ordnungsgemäßen Funktion des Geräts und des Fehlens von Querströmungen Rhodamin B in den Eingangsbehälter von Kammer Nr. 3 gegeben. Dieser rot fluoreszierende Farbstoff hat keine toxische Wirkung auf Zellen. Wie erwartet wurde rote Fluoreszenz nur am Ausgang von Kammer Nr. 3 festgestellt, in den anderen vier Kammern fehlte sie jedoch. Die Expression von CHOP::GFP über die Zeit ist in Abb. 2b dargestellt und zeigt bereits nach 8 Stunden Tunicamycin-Exposition eine deutlich höhere Expression in den behandelten Proben. Um den Unterschied im ER-Stress zwischen den Kammern zu quantifizieren, wurde der letzte Zeitpunkt der Behandlung mit Einzelzellauflösung analysiert. Die 20-stündige Tunicamycin-Exposition führte zu einem 15-fachen Anstieg der CHOP::GFP-Expression (Abb. 2c).

Die Einzel- und Multi-Input-Betriebsmodi können genutzt werden, um jedes gewünschte Protokoll umzusetzen, beispielsweise die direkte Abgabe von Fixiermitteln (z. B. Paraformaldehyd) und markierten Antikörpern an die Zellen. Wasch- und Färbeschritte etablierter Immunfärbungsprotokolle können repliziert werden, mit dem Vorteil eines effektiven Reagenzverbrauchs von weniger als einem Mikroliter, der Signalverstärkung aufgrund der Perfusion und einer Reduzierung der Protokolldauer von Stunden auf Minuten. Um diese Möglichkeit aufzuzeigen, führten wir eine Immunfärbung des humanen epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors 2 (HER2) in zwei Brustkrebszelllinien (AU565 und HCC38 als Negativkontrolle) durch. HER2 ist ein Membranprotein und wird bei einigen Formen von Brustkrebs überexprimiert. Es ist ein klinisch relevanter Biomarker für die Diagnose von Brustkrebs. Krebszellen, die HER2 exprimieren (HER2+), proliferieren stärker, führen aber zu einer besseren Prognose, während diejenigen, die HER2 nicht exprimieren (HER2−), resistenter gegen zytotoxische Chemotherapie sind19. Aus diesem Grund ist die Unterscheidung zwischen diesen beiden Tumorarten wichtig, um über die durchzuführende Therapiestrategie zu entscheiden. Hier wurden HER2+ (AU565) und HER2− (HCC38) Brustkrebszelllinien verwendet, um das Immunfluoreszenzprotokoll in VersaLive zu validieren. Die beiden Zelltypen wurden auf zwei verschiedenen VersaLive-Chips kultiviert, chemisch fixiert und mittels Anti-HER2-Immunfärbung direkt auf dem Gerät fluoreszierend markiert. Wie in Abb. 3a, b gezeigt, war die Immunfärbung auf dem Chip zelltypspezifisch und führte zur korrekten Membranlokalisierung des HER2-Rezeptors. Nach der quantitativen Analyse lässt sich erkennen, dass die 10-minütige Färbung mit VersaLive im Vergleich zur herkömmlichen Methode auf einem Objektträger zu einer 12-fach höheren Intensität führte. Interessanterweise ist nur ein kleiner Intensitätsunterschied spürbar, wenn die Objektträger 1 Stunde statt 10 Minuten inkubiert werden. Wir bringen diesen Anstieg der Signalintensität und Bildqualität mit der Perfusion in Verbindung, die die Ansammlung markierter Antikörper – und damit des Signals – im Laufe der Zeit ermöglicht. Diese Akkumulation ist in herkömmlichen Protokollen nicht möglich.

a, b On-Chip-Immunfluoreszenz des HER2-Membranrezeptors auf AU565-Zellen (a, Positivkontrolle) und HCC38-Zellen (b, Negativkontrolle). Maßstabsbalken, 150 µm. c Vergleich der IF-Signalintensitäten für die Immunfluoreszenzfärbung auf VersaLive und auf Objektträgern unter Verwendung eines Standardprotokolls. Im Vergleich zu Standard-Objektträgerprotokollen führte IF auf VersaLive zu einer 10-fachen Signalsteigerung bei gleichzeitiger Verkürzung der Prozesszeit und geringerem Reagenzienverbrauch. Schwarze Balken stellen die Medianwerte einzelner ROIs dar (graue Punkte, n = 8). d, e Kultur primärer Zellen des pigmentierten Epithels (RPE) der Netzhaut der Maus. Chemische Fixierung und Immunfärbung auf dem Chip, Markierung von Citrat-Synthase (grün), f-Actin (rot) und Zellkernen (blau). Die RPE-Zellen konnten am Chip haften und dabei ihr charakteristisches dunkles Pigment behalten. Maßstabsbalken, 30 µm. f On-Chip-Plasmidtransfektion von HeLa-Zellen, Kammer Nr. 1 bis Kammer Nr. 5 (ch#n) desselben Chips. Transfektionseffizienz von 25,3 ± 8,8 % (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 5). Maßstabsbalken, 150 μm.

Die Kultur primärer Zellen von Patienten ist von großer Bedeutung für die Diagnose von Krankheiten oder für Forschungszwecke, um Primärzellen aus Tiermodellen zu untersuchen. VersaLive kann ein leistungsstarkes Werkzeug zur Handhabung und Kultivierung von Primärzellen sein. Als Beispiel haben wir Primärzellen kultiviert, die aus RPE-Zellen (Retina Pigment Epithel) der Maus entnommen wurden, um die Möglichkeit des Wachstums von Primärzellen in VersaLive zu demonstrieren. Aus frischem Gewebe gewonnene RPE-Zellen konnten an der Glasoberfläche des Chips haften und wachsen, während sie ihr charakteristisches dunkles Pigment behielten (Abb. 3d, e).

Wir möchten darauf hinweisen, dass VersaLive jedoch nicht für die Erfassung seltener Zellen geeignet ist. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Mikrofluidiksysteme entwickelt, um bestimmte Zelltypen beispielsweise anhand ihres Phänotyps aus einer Großprobe zu isolieren und zu konzentrieren20.

Die liposomale Transfektion ist eine etablierte chemische Methode, um Gene in Zellen einzuschleusen. Das Interesse an den Produkten der Expression dieser Gene kann von Grundlagenwissenschaften über medizinische Wissenschaften bis hin zu industriellen Anwendungen reichen21. Mikrofluidik erwies sich als nützliches Werkzeug zur Steigerung der Ausbeute der transfizierten Zellen bei gleichzeitiger Minimierung des Reagenzienverbrauchs22. Frühere Arbeiten, bei denen die Vorteile der Perfusion ausgenutzt wurden, erforderten jedoch immer noch externe Schlauch- und Pumpsysteme, um Chemikalien in die Chips zu befördern22,23. Die Notwendigkeit zusätzlicher Hardware erhöht die Kosten pro Experiment und die Verwendung von Schläuchen erhöht zwangsläufig das Totvolumen, was bedeutet, dass ein Bruchteil der verwendeten Reagenzien nicht für die eigentliche Transfektion verwendet wird, sondern im Prozess verloren geht. VersaLive hat keine Totvolumina, da keine Schläuche oder ein externes Pumpsystem erforderlich sind. Tatsächlich kann jede Menge an Transfektionsmischung, die am Ende des Perfusionsschritts in den Reservoirs verbleibt, für eine weitere On-Chip-Transfektion zurückgewonnen werden.

Wir haben ein Protokoll für die On-Chip-DNA-Plasmid-Transfektion in VersaLive implementiert, indem wir die lipidbasierte Reagenztransfektion in 96-Well-Platten an die Arbeit auf dem Chip angepasst haben. Anhand eines Screenings in einer 96-Well-Platte ermittelten wir die am besten geeignete Transfektionsmischung aus DNA- und Lipidkomplexkonzentrationen. Es wurde festgestellt, dass die optimale Kombination 300 ng DNA und 0,5 μL Transfektionsreagenz war (Methoden). Für die On-Chip-Transfektion wurden DNA und Lipide mit Zellwachstumsmedium auf ein Endvolumen von 50 μl verdünnt. Aliquots dieser Stammtransfektionsmischung wurden verwendet, um die Zellen über 2 Stunden im Multi-Input-Modus zu perfundieren, wobei der effektive Reagenzverbrauch in der Größenordnung von wenigen Mikrolitern pro Kammer lag. In Abb. 3f zeigen wir das Ergebnis der Transfektion von Zellen mit einem Plasmid, das einen mCherry-Fluoreszenzreporter stromabwärts eines CMV-Promotors exprimiert, wobei eine Transfektionseffizienz von 25,3 % ± 8,8 pro Kammer erzielt wurde. Anschließend verglichen wir die Transfektionseffizienz zwischen VersaLive und einer Standard-96-Well-Platte unter Verwendung desselben Reverse-Transfektionsprotokolls. Die gemessene Transfektionseffizienz in der 96-Well-Platte (27,2 ± 4,6 %) und damit vergleichbar mit VersaLive.

Die Beschichtung der Oberfläche vor der Zellaussaat ist vorteilhaft oder bei manchen Zelltypen erforderlich (z. B. serumfreie Kulturen). VersaLive ist vollständig kompatibel mit jeder Beschichtungslösung mit niedriger Viskosität (z. B. Poly-L-Lysin, Vitronektin, Fibronektin). Als Beispiel für eine Zellkultur in VersaLive mit Beschichtung führten wir eine Live-Zellbildgebung der Tubulation von Transferrin-beladenen Endosomen in HK2-Zellen in VersaLive-Chips durch, die mit einer Vitronektinlösung in PBS beschichtet waren (Zusatzfilm 1).

Abhängig von den untersuchten Zelllinien kann die Scherspannung ein Parameter sein, der bei der Kultivierung unter Durchfluss entweder minimiert oder ausgenutzt werden muss. Bei allen in dieser Arbeit vorgestellten Experimenten bestand das Interesse darin, die Scherbeanspruchung der Zellen zu minimieren, daher erfüllen alle in den Protokollen verwendeten Drücke diese Anforderung. VersaLive eignet sich jedoch auch für Studien, bei denen Scherbeanspruchung Voraussetzung ist. Durch die Platzierung externer Behälter in unterschiedlichen Höhen ist es möglich, den Druck des zugeführten Durchflusses einfach zu regulieren. Durch die Platzierung der Reservoirs 10 cm über dem Chip war es beispielsweise möglich, einen Fluss von 10 mbar auf HeLa-Zellen anzuwenden, was dazu führte, dass die Zellen aus der Kulturkammer ausgewaschen wurden (Zusatzfilm 2).

VersaLive ermöglicht den direkten Zugriff auf die Zellen, indem das PDMS vollständig vom Objektträger entfernt wird, wo es reversibel gebunden wird (ergänzende Abbildung 1a, b). Wir gehen davon aus, dass diese Funktion für die Neuplattierung von Zellen, die Zellsequenzierung und alle Anwendungen nützlich sein wird, die eine vollständige Rückgewinnung der Probe erfordern. Um zu zeigen, dass die PDMS-Entfernung die Zellen nicht schädigt, wurde das gleiche Sichtfeld in der Live-Bildgebung und für die chemisch fixierte Probe nach der PDMS-Entfernung erfasst (ergänzende Abbildung 1c, d). Darüber hinaus kann VersaLive zur selektiven und präzisen Rückgewinnung des Kammerinhalts eingesetzt werden. In der ergänzenden Abbildung 2a – f haben wir die Abfolge der Vorgänge in VersaLive beschrieben, um den Inhalt jeder Kammer von Kammer Nr. 1 bis Kammer Nr. 5 selektiv zu lysieren. Mithilfe des beschriebenen Protokolls ist es möglich, die Kammerlysate in separaten Anschlüssen zu sammeln, wodurch jegliches Risiko einer Kreuzkontamination ausgeschlossen wird. Durch das Leeren jeweils eines Reservoirs oder aller auf einmal eignet sich dasselbe Protokoll für eine sequentielle oder parallele Inhaltswiederherstellung.

Die in der ergänzenden Abbildung 2a – f dargestellten Vorgänge werden mit gefärbten Lösungen durchgeführt, um die Fließwege hervorzuheben. Um die ordnungsgemäße Funktion dieses Protokolls zu demonstrieren, wurde die RNA der Zellen aus jeder Kammer gesammelt, eine Sequenzierungsbibliothek erstellt und ihre Qualität mit dem TapeStation-Instrument analysiert, um ihre Größenverteilung zu bestimmen (ergänzende Abbildung 2g). Die Daten zeigen, dass die RNA aus allen Kammern erfolgreich gewonnen werden konnte, trotz einiger Unterschiede in der Menge der extrahierten RNA.

VersaLive bietet eine einfach zu adaptierende Mikrofluidik-Plattform für Säugetierzellen, die die Wahl zwischen Perfusion und statischer Zellkultur ermöglicht und für den Betrieb keine externen Komponenten benötigt. VersaLive ermöglicht außerdem den direkten Zugriff auf die kultivierten Zellen, wodurch der Verbrauch von Reagenzien und Plastikartikeln reduziert wird. Zusätzliche Protokolle können einfach an VersaLive angepasst werden, indem die im makroskopischen Kultursystem verwendeten Konzentrationen neu skaliert werden, mit dem zusätzlichen Vorteil, dass Kosten gesenkt und Reaktionen beschleunigt werden.

Im Vergleich zur Multi-Well-Platten-Zellkultur bietet VersaLive mehrere Vorteile, aber auch einige Einschränkungen, die in Tabelle 1 schematisch zusammengefasst sind. VersaLive verringert den Verbrauch von Reagenzien und Laborplastikartikeln im Vergleich zur Multi-Well-Platten-Zellkultur. Insgesamt führt dies zu einer Verringerung der Kosten pro Experiment. Darüber hinaus gibt VersaLive dem Benutzer die Möglichkeit zu entscheiden, ob er mit einer herkömmlichen statischen Zellkultur, ähnlich wie bei Multi-Well-Platten, fortfahren oder eine Perfusionszellkultur implementieren möchte, wie bei teureren und sperrigeren kommerziellen Aufbauten. Die Implementierung der statischen Zellkultur in VersaLive oder in mikrofluidischen Systemen im Allgemeinen ahmt die physiologischen Bedingungen für das Zellwachstum aufgrund der geringeren Volumina besser nach, selbst im Vergleich zu Multi-Well-Formaten (z. B. Erhöhung der Konzentration sekretierter Faktoren, optimierte geometrische Einschränkungen). Vorteile, die in der Zellkultur mit mehreren Wellplatten nicht erreichbar sind. Die Perfusionszellkultur hat gegenüber statischen Kulturmethoden eine Reihe von Vorteilen, wie z. B. die Implementierung eines kontinuierlichen Nährstoffflusses, um eine Erschöpfung im Laufe der Zeit zu vermeiden; Aufrechterhaltung einer konstanten Konzentration eines Arzneimittels oder eines kleinen Moleküls über einen längeren Zeitraum; und Beschleunigung von Standardprotokollen.

Einige der aktuellen Einschränkungen von VersaLive sind der geringe Durchsatz mit bis zu fünf Kammern pro Chip, der jedoch durch die Verwendung derselben Topologie, aber einer Erhöhung der Länge des Hauptkanals und damit der Anzahl der damit verbundenen Kammern erhöht werden könnte. Darüber hinaus ist die Rückhaltekapazität der Zellfilter nur für Zellen mit einem Durchmesser von mehr als 5 μm wirksam, während die maximale Versuchsdauer ohne Eingriff eines Bedieners etwa 24 Stunden beträgt. Es ist jedoch möglich, die Dauer eines Experiments zu verlängern, indem man an den Reservoirs angebrachte Pipettenspitzen verwendet, um die Volumenkapazität zu erhöhen. Trotz dieser Einschränkungen sind wir davon überzeugt, dass VersaLive einen einzigartigen Einstiegspunkt mit niedrigen Barrieren für Labore bietet, die an der Einführung von Mikrofluidik in ihren Säugetierzellkulturaktivitäten interessiert sind. Obwohl es viele mikrofluidische Geräte gibt, die zur Durchführung der hier beschriebenen einzelnen Protokolle verwendet werden können, ist unseres Wissens nach keines dieser Geräte für Pipetten-basierte Mehrzweckanwendungen konzipiert. Somit bietet VersaLive einen einzigartigen Vorteil für jene Forscher, die von den Vorteilen der mikrofluidischen Zellkultur profitieren möchten, sich aber von der Komplexität, den Kosten der notwendigen Ausrüstung und dem erforderlichen Fachwissen abschrecken lassen. Wir glauben, dass VersaLive dazu beitragen kann, die Mikrofluidik für Säugetierzellen zu „demokratisieren“ und so dazu beizutragen, die experimentelle Reproduzierbarkeit zu erhöhen und gleichzeitig den Einsatz von Reagenzien zu minimieren.

Die VersaLive-Technologie ist Open Source und alle Protokolle und Materialien sind online verfügbar (https://versalive.tigem.it/).

Die mikrofluidische Plattform VersaLive wurde mit Autodesk Fusion 360 entworfen. Das Geschwindigkeitsprofil des Chips wurde mit der Finite-Elemente-Methode (COMSOL Multiphysics 5.4) modelliert. In den simulierten Nutzungsmodi (Abb. 2) wurde an jedem Einlass ein Druck von 0,5 mbar angelegt, während die Auslässe auf Nulldruck eingestellt waren. Dieser Druckwert wurde gewählt, weil er einem hydrostatischen Druck von 5 mm entspricht, wenn die Behälter bis zum Maximum ihrer Volumenkapazität gefüllt sind. Die Strömungsrichtung in den Simulationsdiagrammen wurde durch Pfeile angezeigt, deren Abmessungen die Größe der Geschwindigkeit in einer logarithmischen Skala widerspiegeln. Ein 2D-CAD-Modell des Chips wurde in Autodesk AutoCAD 2020 exportiert, um die druckbare Fotolithographiemaske zu entwerfen.

Mikrofluidische Chips wurden mithilfe einer Kombination aus Standard-Photolithographie- und Soft-Lithographie-Verfahren hergestellt24. Die Masterform wurde mittels Maskenfotolithographie aus SU-8-Negativfotolack (SU-8 3035, Kayaku Advanced Materials Inc.) auf einem Siliziumwafersubstrat mikrogefertigt. Der Fotolack wurde durch Schleuderbeschichtung auf eine Enddicke von 25 µm aufgetragen und gemäß den Richtlinien des Herstellers verarbeitet. Die Merkmalshöhe wurde durch Messung mittels optischer Mikroskopie des Querschnitts einer Silikonnachbildung der Kanäle bestätigt. Vor der ersten Verwendung des Masters ist eine Passivierung seiner Oberfläche erforderlich, um den Freigabeschritt während der Soft-Lithographie zu erleichtern. Der Master wurde durch Aufdampfen von Perfluorsilan (1H,1H,2H,2H-Perfluoroctyltrichlorsilan, Merck kGaA) passiviert. Konkret wurde der Master in einen Exsikkator mit einem kleinen Fläschchen mit 20 µL Perfluorsilan gegeben. Anschließend wurde über Nacht Vakuum angelegt, damit das Perfluorsilan verdampfen und mit der Oberfläche des Siliziumwafers reagieren konnte, wodurch eine kovalent gebundene superhydrophobe Beschichtung entstand. Der passivierte Master wurde dann als Form für den Soft-Lithographie-Teil des Herstellungsprozesses des Mikrofluidikgeräts verwendet. Die mikrofluidische Plattform von VersaLive besteht aus einem Silikonelastomer (PDMS), das mit einem Glasobjektträger verbunden ist. Die Elastomerbasis des PDMS wurde gründlich mit dem Härter im Verhältnis 10:1 gemischt, wie im Datenblatt des Herstellers (Sylgard 184, Dow Corning) angegeben. Luftblasen wurden aus dem ungehärteten Polymer entfernt, indem 2 Stunden lang oder bis keine Blasen mehr sichtbar waren, Vakuum an die Mischung angelegt wurde. Anschließend wurde die Mischung bis zu einer Enddicke von etwa 5 mm auf die Urform gegossen. Bei Bedarf wurde ein zweites Mal Vakuum angelegt, um die beim Gießschritt entstandenen Blasen zu entfernen. Die Form mit dem ungehärteten PDMS wurde dann für mindestens 2 Stunden in einen Ofen bei 80 °C gestellt, um die Vernetzung der Polymermischung zu beschleunigen. Nach dem Aushärten wurde das PDMS von der Masterform abgezogen. Anschließend wurde die PDMS-Platte mit den Mustermerkmalen nach oben platziert, um die einzelnen Chips auszuschneiden. In ähnlicher Weise wurden Zugangsöffnungen mit einer 3-mm-Biopsiestanze geöffnet (Ref. 504649, World Precision Instruments). Die Kanäle der PDMS-Chips wurden durch Plasmabonden der Chips mit einem runden Glasdeckobjektträger (30 mm Durchmesser, Dicke Nr. 1, Marienfeld) versiegelt. Glasobjektträger und PDMS-Chips wurden zunächst mit Klebeband von Staubpartikeln befreit. Zur Oberflächenaktivierung von Glasobjektträgern und PDMS-Chips wurde 85 W Luftplasma bei 0,4 mbar oder weniger (ZEPTO Version B, Diener electronic GmbH & Co. KG) verwendet. Für die permanenten bzw. reversiblen Bindungen wurden 30 bzw. 10 Sekunden Luftplasma verwendet. Der Chip wurde dann in einen Aluminiumlinsentubus (SM30L05, ThorLabs) gelegt, der als Chiphalter diente. Der Linsentubus ermöglichte den sicheren Transfer des Chips während des experimentellen Arbeitsablaufs (z. B. Werkbank, Inkubator, Mikroskop). Um eine einfache und zuverlässige Bildaufnahme zu ermöglichen, wurde das Nikon-Mikroskop mit einer maßgeschneiderten Halterung für die Linsentuben aus 2 mm starkem, lasergeschnittenem Acryl ausgestattet.

HeLa WT wurde zusammen mit den Brustkrebszelllinien AU565 und HCC38 von ATCC gekauft und in RPMI 1640-Zellmedium (ohne L-Glutamin, EuroClone) gezüchtet. CHO-K1-Reporterzellen (freundliches Geschenk von Prof. David Ron)18 wurden in F-12-Zellmedium (Gibco) gezüchtet. Beide Zellmedien wurden mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, EuroClone), 1 % L-Glutamin (EuroClone) und 1 % Penicillin-Streptomycin (EuroClone) ergänzt.

Die humane proximale Tubulusepithelzelllinie (HK2) wurde von ATCC (#CRL-2190) gekauft. HK2-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F12, Gibco) kultiviert, ergänzt mit 5 % FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 U/ml Antibiotika (Penicillin/Streptomycin) und 1 % Insulin-Transferrin-Selen ( ITS-Sigma Aldrich).

Die Zellen wurden in einem Zellinkubator bei 37 °C, 100 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2-Atmosphäre gehalten. Vor dem Laden eines Mikrofluidikgeräts wurde der Inhalt eines T25-Kolbens bei 90 % Konfluenz gemäß dem folgenden Verfahren gesammelt. Zunächst wurde das verwendete Zellmedium entfernt und die Zellen mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Kalzium und Magnesium (PBS, EuroClone) gespült. Um die Zellen vom Kolben zu lösen, wurden 0,5 ml 0,05 % Trypsin-EDTA (Gibco) hinzugefügt und der Kolben für zwei Minuten wieder in den Inkubator gestellt. Um das Trypsin zu deaktivieren, wurden 2 ml Zellmedium in den Kolben gegeben und die Zellen wurden gründlich gemischt, bis alle sichtbaren Aggregate entfernt waren. Die resultierende Zellsuspension wurde direkt für die Beladung des Chips verwendet. Das primäre Pigmentepithel der Maus-Retina (RPE) war ein Geschenk von Sabrina Carrella, PhD (TIGEM) und wurde wie zuvor beschrieben erhalten25.

Die für die PDMS-Glas-Verbindung verwendete Plasmabehandlung verleiht der Oberfläche der Kanäle auch eine vorübergehende Hydrophilie24,26. Eine hydrophile Kanaloberfläche ist der Schlüssel dafür, dass wasserbasierte Lösungen in die Mikrokanäle fließen (dh benetzen) können. Um den Fertigungsablauf einer Chip-Charge zu optimieren, wurde der Benetzungsprozess innerhalb von Minuten nach dem Bondvorgang durchgeführt. Zur Benetzung der Mikrofluidikkanäle wurden 10 µL PBS in Port B des Chips gegeben, bis alle Kanäle gefüllt waren. Bei Bedarf wurden alle Anschlüsse mit 10 µL PBS gefüllt und der Chip in einen Exsikkator gegeben und 15 Minuten lang oder bis alle Luftblasen verschwunden waren, Vakuum angelegt. Für eine Langzeitlagerung (4–6 Wochen) wurden alle Reservoirs des Chips mit 20 µL PBS gefüllt, die PDMS-Seite der Chips mit Klebeband (Scotch Magic Tape, 3 M) versiegelt und die Chips bei + gehalten Bis zur Verwendung bei 4 °C aufbewahren.

Zum Beladen der Zellen wird das zur Benetzung der Kanäle verwendete PBS aus allen Reservoirs entfernt und 10 µL Zellsuspension (1–5 × 106 Zellen/ml) in Port B des Geräts gegeben. Beim Füllen des Reservoirs beginnen die Zellen sofort, durch den Hauptkanal zu fließen und in die Kammern einzudringen (Abb. 2b). Wenn eine bestimmte Kammer mit der geeigneten Anzahl von Zellen gefüllt ist, werden 10 µL Zellmedium in den entsprechenden Anschluss gegeben, um die Durchflussrate durch diese Kammer zu verringern. Wenn alle Kammern mit Zellen gefüllt sind, werden 20 µL Zellmedium zu Anschluss A gegeben und Anschluss B geleert, um den Hauptkanal von unerwünschten Zellen zu reinigen. Port B wird dann von den restlichen Zellen gespült und mit 20 µL Zellmedium gefüllt. Als nächstes werden alle Eingangsanschlüsse von Nr. 1 bis Nr. 5 auf ein Endvolumen von 20 µL frischem Zellmedium gefüllt. Ein gleiches Volumen an Zellmedien in allen Anschlüssen verhindert die Bildung von Druckverlusten über den Chip und ermöglicht die statische Zellkultur. Abschließend werden jedem Reservoir 2,5 µL Mineralöl für die Zellkultur (M8410, Merck kGaA) zugesetzt, um die Verdunstung des Inhalts zu verhindern. Die Chips blieben vor Beginn der Experimente über Nacht im Inkubator bei 37 °C, 100 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2-Atmosphäre. Die Ergebnisse der Benetzungs- und Zellladevorgänge wurden mit einem inversen Stereomikroskop (Leica Microsystems) überprüft.

Zeitrafferaufnahmen von CHO-K1-Zellen wurden mit einem Nikon Ti Eclipse-Mikroskop erfasst, das mit einer Quecksilberlampe (Intensilight, Nikon), einer EMCCD-Digitalkamera (iXon Ultra 897, Andor Technology Ltd) und einer Inkubationskammer (H201-OP R2, Okolab). Vor der Montage des Chips wurde der Inkubator auf eine Temperatur von 37 °C und mit 5 % CO2 befeuchtete Luft gebracht. Zeitrafferaufnahmen von bis zu 20 Stunden wurden mit einem ×40-Luftobjektiv (CFI Plan Fluor DLL ×40, 0,75 NA, Nikon Instruments) erfasst, um das höchstmögliche Signal zu erfassen. Aufgrund der außermittigen Position der Kammer Nr. 5 in diesem speziellen Gerät war die Aufnahme dieser Kammer mit diesem Objektiv in unserem Mikroskop jedoch nicht möglich. Für die Einzelzellanalyse wurde die Fluoreszenz der Zellen aus allen Kammern am Ende der 20-stündigen Behandlung mit einem ×20-Luftobjektiv (CFI Plan Fluor DLL ×20, 0,5 NA, Nikon Instruments) erfasst. Abhängig vom Experiment wurden Bilder im Phasenkontrast (PC) und Epifluoreszenz für grüne, rote und gelbe Wellenlängen unter Verwendung der in Tabelle 2 angegebenen Belichtungszeiten und Filtersätze gesammelt.

Nach der Aussaat über Nacht wurden VersaLive-Chips mit CHO-K1-Zellen in statischer Kultur aus dem Inkubator entfernt. Zu jedem Chip wurden die Behälter A und B geleert. Als nächstes wurde der Inhalt der Reservoirs Nr. 2 und Nr. 4 mit 15 µL frischem F12-Zellmedium erneuert. Anschließend wurde der Inhalt der Reservoirs Nr. 1, Nr. 3 und Nr. 5 durch 15 µL Tunicamycin 0,5 µg/ml in F12-Zellmedium ersetzt. Dann wurde 1 µL Sulforhodamin B 0,1 mg/ml (Merck kGaA) als Durchflussindikator in Reservoir Nr. 3 gegeben. Zu allen gefüllten Reservoirs (Nr. 1 bis Nr. 5) wurden 2,5 µL Mineralöl für die Zellkultur gegeben, um deren Verdunstung zu verhindern. Die Behälter A und B blieben leer. Der Chip wurde dann zur Bildgebung lebender Zellen für eine Zeitrafferaufnahme von 20 Stunden in Abständen von 15 Minuten zwischen den einzelnen Aufnahmen am Mikroskop montiert.

Um die Stressreaktion von mit Tunicamycin behandelten und unbehandelten CHO-K1-Zellen zu quantifizieren, wurden Live-Zellmikroskopiebilder mit dem Trainable WEKA Segmentation27-Plugin in der ImageJ-Software analysiert. Kurz gesagt, die Software wurde darauf trainiert, CHO-Zellen in den Kulturkammern von VersaLive zu unterscheiden. Die von der Software zurückgegebene Wahrscheinlichkeitskarte wurde mit einem Schwellenwert versehen, um in eine segmentierte Maske umgewandelt zu werden. Die Maske wurde dann über das Originalbild gelegt. Die durchschnittlichen Intensitäten der resultierenden Einzelzellen wurden zur Quantifizierung ihrer Stressreaktion verwendet.

Die Brustkrebszelllinien AU565 und HCC38 wurden auf VersaLive-Chips geladen und über Nacht in einer statischen Zellkultur gezüchtet, wie in einem vorherigen Abschnitt dieser Arbeit beschrieben. Für die chemische Fixierung auf dem Chip wurden nach Entfernung des Zellmediums alle Ports mit 20 μl PBS gewaschen. Die Zellen wurden im Multi-Input-Modus 10 Minuten lang mit Paraformaldehyd (PFA, 4 % w/v in PBS) perfundiert. Als nächstes wurden alle Ports zweimal mit 20 μl PBS gewaschen, gefolgt von einer 5-minütigen Perfusion von PBS im Multi-Input-Modus. Um die Fluoreszenz von PFA zu löschen, wurde eine Blockierungslösung (50 mM NH4Cl; 0,5 % BSA in PBS) im Multi-Input-Modus 30 Minuten lang perfundiert. Abschließend wurden alle Ports mit 20 μl PBS gewaschen. Für die On-Chip-Immunfärbung wurde der 1:100 in Blockierungspuffer verdünnte Anti-HER2-Antikörper (BB700 Mouse Anti-Human Her2/Neu, BD OptiBuild) im Multi-Input für eine durch das Experiment definierte Zeit (10 oder 30 Minuten) perfundiert. . Anschließend wurden alle Ports zweimal mit 20 μl PBS gewaschen. Um die Probe zu konservieren, wurden alle Anschlüsse mit 20 μl PBS und 2,5 μl Mineralöl für die Zellkultur gefüllt, um eine Verdunstung zu verhindern. Die Proben wurden bei 4 °C gelagert.

Die Brustkrebszelllinien AU565 (ERBB2+, Positivkontrolle) und HCC38 (ERBB2−, Negativkontrolle) wurden bei 60–70 % Konfluenz auf Glasdeckgläsern (EXACTA-OPTECH, Fläche 10 × 10 mm2, Dicke 0,13–0,16 mm) in 24 Fällen ausgesät -Well-Platte.

Nach 1-maligem Waschen mit PBS wurden die Zellen 10 Minuten lang mit 4 % PFA fixiert und dann 1-mal mit PBS gewaschen. Nach der Fixierung wurden die Zellen dann mit Blockierungspuffer, hergestellt mit BSA 0,5 % (Sigma-Aldrich) und NH4Cl 50 mM (Sigma-Aldrich) in PBS 1x, für 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT) blockiert. Die Zellen wurden in einer feuchten Umgebung bei RT im Dunkeln mit 1:100 Primärantikörper (BB700-konjugierter Maus-Antihuman-ERBB2-Ab, BD Bioscience) inkubiert. Die Inkubationszeit wurde gemäß dem Versuchsplan festgelegt. Der Primärantikörper wurde in Blockierungspuffer hergestellt.

Nach der Antikörper-Inkubation wurden die Zellen dreimal mit PBS 1x und noch einmal mit ddH2O gewaschen. Anschließend wurden Deckgläser in Fluoroshield™ mit DAPI (Sigma-Aldrich) montiert und Fluoreszenzbilder mit einem Nikon Ti Eclipse-Mikroskop aufgenommen, das mit einer Quecksilberlampe (Intensilight, Nikon) und einer EMCCD-Digitalkamera (iXon Ultra 897, Andor Technology Ltd) ausgestattet war. und ein ×20-Luftobjektiv (CFI Plan Fluor DLL ×20, 0,5 NA, Nikon Instruments).

Primäre Maus-RPE-Zellen wurden auf VersaLive-Chips geladen und über Nacht in einer statischen Zellkultur an der Oberfläche des Mikrofluidik-Chips haften gelassen, wie in einem vorherigen Abschnitt dieser Arbeit beschrieben. Die chemische Fixierung auf dem Chip wurde wie zuvor für die Krebszelllinien beschrieben durchgeführt. Die Immunfärbung auf dem Chip wurde durch 10-minütige Perfusion des Permeabilisierungspuffers (0,3 % Triton X-100, 5 % FBS in PBS) im Multi-Input-Modus eingeleitet. Als nächstes wurde der Anti-Citrat-Synthase-Primärantikörper (ab96600, Abcam) in Blockierungspuffer (0,5 % BSA, 0,05 % Saponin, 50 mM NH4Cl, 0,02 % NaN3 in PBS) im Multi-Input-Modus 10 Minuten lang perfundiert. Alle Ports wurden dann mit 20 μl PBS gewaschen. Nacheinander wurden fluoreszierend markierte Esel-Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 488 (A-21206, Thermo-Fisher Scientific), Alexa Fluor 568 Phalloidin (A-12380, Thermo Fisher Scientific) und DAPI (D1306, Thermo Fisher Scientific) 10 Minuten lang perfundiert Multi-Input-Modus zur Färbung von Mitochondrien, F-Aktin bzw. Kernen. Anschließend wurden alle Ports zweimal mit 20 μl PBS gewaschen. Um die Probe zu konservieren, wurden alle Anschlüsse mit 20 μl PBS und 2,5 μl Mineralöl für die Zellkultur gefüllt, um eine Verdunstung zu verhindern. Die Proben wurden bei 4 °C gelagert.

Primäre Maus-RPE-Zellen wurden mittels konfokaler Mikroskopie (LSM 700, ZEISS Microscopy) abgebildet, die mit 405-, 488- und 555-nm-Lasern und einem 40-fachen Ölobjektiv (EC Plan-Neofluar × 40/1,30 Oil DIC) ausgestattet war. Für die Aufnahme wurden DAPI- (blau), FITC- (grün) und Texas Red- (rot) Filter verwendet.

VersaLive-Chips wurden mit verkürztem humanem rekombinantem Vitronektin (5 μg/ml in PBS 1×) beschichtet, wobei der Chip vor dem Laden der Zellen 30 Minuten lang im Multi-Input-Modus bei Raumtemperatur verwendet wurde. Nach dem Laden der Zellen auf den Chip wurden die Zellen über Nacht im Inkubator (37 °C, 5 % CO2) haften gelassen. Zum Zeitpunkt des Experiments wurden HK2-Zellen im Multi-Input-Modus 30 Minuten lang bei 37 °C mit serumfreiem Medium mit 50 μg/ml Alexa Fluor 488-konjugiertem Transferrin (T13342, Thermo Fisher Scientific) perfundiert, um eine Endozytose zu ermöglichen Beladung mit Recycling-Endosomen. Dann wurde das Medium gewechselt und serumfreies Medium mit 50 μg/ml unmarkiertem Transferrin hinzugefügt, um das Recycling von Alexa Fluor 488-konjugiertem Transferrin zu ermöglichen, das durch Live-Bildgebung unter Verwendung eines Nikon Ti-Mikroskops mit einem rotierenden Scheibenmodul und einem bewertet wurde ×100 1,5 NA Ölobjektiv.

Für die On-Chip-Transfektion wurden HeLa-Zellen einen Tag vor der Transfektion nach dem bereits beschriebenen Verfahren geladen. Der Transfektionsmix (Lipofectamine™ 3000 Transfection Reagent, ThermoFisher Scientific) wurde gemäß den Herstellerrichtlinien hergestellt und auf die VersaLive-Volumina optimiert. Die Mischung enthielt 300 ng DNA, 0,5 μl Lipofectamin-Reagenz, 0,6 μl P3000-Reagenz und 10 μl Opti-MEM-Medium. Diese Mischung wurde dann in vollständigem Wachstumsmedium auf ein Endvolumen von 50 μl verdünnt. Die Zellen wurden im Multi-Input-Modus 2 Stunden lang in einem Zellinkubator perfundiert, wobei in jedem Kammeranschluss 5 μl verdünntes Transfektionsgemisch und Mineralöl hinzugefügt wurden, um ihre Verdunstung zu verhindern. Nach der Transfektion wurde die Mischung durch vollständiges Wachstumsmedium ersetzt und der Chip 24 Stunden lang im statischen Single-Input-Modus in einem Zellinkubator belassen. Anschließend wurden Bilder mit dem Nikon Ti Eclipse-Mikroskop aufgenommen.

Hela-Zellen wurden mit pCMV-NLS-mcherry-ccp3, das durch Golden-Gate-Klonierung (EMMA-Toolkit) erhalten wurde, und einem leeren Vektor unter Verwendung von Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers revers transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet, um die Fluoreszenz mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierungsanalyse (FACS) zu messen.

Die Auswirkung der Verdunstung an den Einlassreservoirs wurde durch den Betrieb zweier verschiedener Mikrofluidikgeräte im Multi-Input-Modus bewertet. Die Eingangsreservoirs Nr. 1, Nr. 2, Nr. 4 und Nr. 5 wurden mit 25 µL entionisiertem Wasser gefüllt; Eingangsreservoir Nr. 3 wurde mit 25 µL Rhodamin B (0,1 mg/ml) gefüllt. Bei einem der beiden Geräte wurden 2,5 µL Mineralöl für die Zellkultur in die Einlassreservoirs gegeben, um deren Verdunstung zu verhindern. Die Intensität von Rhodamin B wurde in der Kulturkammer über 15 Stunden in 15-Minuten-Intervallen gemessen. Die Messungen wurden unter den gleichen Versuchsbedingungen durchgeführt, die für Experimente mit der Lebendzellmikroskopie verwendet wurden. Die Daten wurden mit der ImageJ-Software verarbeitet.

Um das Entfernen des PDMS zu erleichtern, wurde eine einschneidige Rasierklinge vorsichtig an der Schnittstelle zwischen dem PDMS und dem Glasobjektträger entlang des gesamten Umfangs des Chips eingeführt (ergänzende Abbildung 1a). Nacheinander wurde der PDMS-Chip eingeklemmt, um ihn vom Glasobjektträger abzuziehen, der die Kanäle versiegelte (ergänzende Abbildung 1b). Für die chemische Fixierung außerhalb des Chips wurde der PDMS-Chip zunächst vom Objektträger entfernt. Anschließend wurde der Glasobjektträger mit den freigelegten Zellen mit PBS gespült und später 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in die 4 Gew.-%ige PFA-Lösung getaucht. Anschließend wurde der Objektträger mit PBS gespült und vorsichtig getrocknet.

Poly(A)-RNA wurde mithilfe von Poly(T)-Harz-Mikropartikeln eingefangen, wie zuvor von den Autoren in Lit. beschrieben. 11,28. Der Lysepuffer mit der in der Literatur28 beschriebenen Zusammensetzung wurde vor Beginn der Experimente 1:1 in PBS 1x verdünnt. Vor jedem Extraktionslauf wurde eine Stammsuspension von Perlen in Lysepuffer (3000 Perlen/μL) hergestellt.

Die Sequenz zur Rückgewinnung des Chipinhalts beginnt mit dem Chip im Multi-Input-Modus (10 μl pro Reservoir, ergänzende Abbildung 2a). Als nächstes wird Port A mit Lysepuffer (7,5 μL) gefüllt. In dieser Konfiguration kann der Lysepuffer durch den Hauptkanal fließen, jedoch nicht in die Kammern gelangen. Um die Lyse einer Kammer zu starten, reicht es jedoch aus, das entsprechende Kammerreservoir zu leeren (ergänzende Abbildung 2b – f). Um die Poly(A)-RNA zu sammeln und vor dem Abbau zu schützen, wurde an jedem Port (Nr. 1 bis Nr. 5) ein Aliquot Perlen (3 μl) platziert. Diese Menge reichte aus, um die Bodenfläche des Anschlusses zu bedecken, ohne einen Gegendruck zu erzeugen. Nach 10 Minuten waren in den Kammern keine Zellen mehr sichtbar und der Lysevorgang galt als abgeschlossen.

Harzmikropartikel wurden aus jedem Kammerreservoir (Nr. 1 bis Nr. 5) gewonnen und in 200-μL-Röhrchen gegeben. Anschließend wurden die Mikropartikel zweimal mit 100 μl SSC 6X und einmal mit 100 μl RT-Puffer gewaschen. Alle Zentrifugationsschritte wurden 1 Minute lang bei 1000 × g durchgeführt. Die Schritte der reversen Transkription, der Exonuklease, der PCR und der Reinigung der cDNA-Bibliothek wurden wie in der Literatur beschrieben durchgeführt28. Die amplifizierte cDNA wurde mit dem Ampure XP Bead-Protokoll gereinigt. Zu jeder Probe wurde ein 0,6-faches Volumen (Probenvolumen/Volumen der Ampure XP-Perlen) Ampure XP-Perlen hinzugefügt. Abschließend wurde die cDNA in 10 μl RNAse-freiem Wasser eluiert. Die quantitative und qualitative Analyse jeder Probe wurde mit einem hochempfindlichen TapeStation D5000-Chip durchgeführt.

Die Bildanalyse und Datenverarbeitung wurde mit ImageJ und Microsoft Excel durchgeführt und Fehlerbalken stellen den Medianwert ± SD dar, sofern nicht anders angegeben. Replikate sind biologisch und stellen Experimente an derselben Zelllinie dar, die jedoch an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden. Die Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt. Die Stichprobengröße variierte je nach Methodik und wird in den Abbildungslegenden definiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Das druckbare Design für den Tischinkubatoradapter OkoLab H101 für das Nikon Ti-Lichtmikroskop wird als „Supplementary Data 1.dxf“ bereitgestellt. Alle während der aktuellen Studie generierten und analysierten Roh- und verarbeiteten Daten (z. B. Bilder, Tabellen, Segmentierungsmasken) werden als „Supplementary Data 2.zip“ bereitgestellt. Die mit Transferrin beladene Endosomen-Tubulation in HK2-Zellen wird als „Supplementary Movie 1.avi“ bereitgestellt. Die Auswirkung hoher Scherbeanspruchung auf HeLa-Zellen auf dem Chip wird als „Supplementary Movie 2.avi“ bereitgestellt.

Eine Korrektur zu diesem Artikel wurde veröffentlicht: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04059-4

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Diese Arbeit wurde von der Fondazione Telethon, der Universität Neapel „Federico II“ und der Compagnia di San Paolo (STAR Plus 2020 Linea 1) an DdB, das COSY-BIO-Projekt an DdB (EU H2020-Zuschuss 766840) unterstützt. GN wurde von „OPL-APPS – IIoT OPEN Platform e Applicazioni per il Manufacturing“ (Zuschuss PON ARS01_00615) und SC und SB von der BrightFocus Foundation (Zuschuss M2020184) unterstützt. Wir möchten Giuliano De Carluccio und Alessio Mallozzi für ihre Hilfe bei der Plasmidtransfektion danken und die Verwendung von Mineralöl bzw. CHO-K1-Zellen-Experimenten vorschlagen.

Telethon Institute of Genetics and Medicine (TIGEM), Via Campi Flegrei 34, 80078, Pozzuoli, NA, Italien

Giovanni Marco Nocera, Gaetano Viscido, Stefania Criscuolo, Simona Brillante, Fabrizia Carbone, Leopoldo Staiano, Sabrina Carrella und Diego di Bernardo

Fakultät für Elektrotechnik und Informationstechnologie, Universität Neapel Federico II, Neapel, Italien

John Mark Nocera

CEINGE Advanced Biotechnology, Neapel, Italien

John Mark Nocera

Abteilung für Chemie-, Werkstoff- und industrielle Produktionstechnik, Universität Neapel Federico II, Neapel, Italien

Gaetano Viscido & Diego di Bernardo

Institut für genetische und biomedizinische Forschung, Nationaler Forschungsrat (CNR), Mailand, Italien

Leopold Staiano

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GMN hat das Gerät entworfen und Experimente durchgeführt und überwacht. GV, SB und S. Carrella führten Immunfärbungsexperimente durch. FC und LS führten Transferrin-Recycling-Assays durch. S. Criscuolo führte Plasmidtransfektionsexperimente durch. DdB konzipierte die Idee und betreute die Arbeiten. GMN und DdB haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Diego di Bernardo.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Bowei Li, Carla Mulas und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteurin: Eve Rogers.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Nocera, GM, Viscido, G., Criscuolo, S. et al. Die VersaLive-Plattform ermöglicht mikrofluidische Säugetierzellkulturen für vielseitige Anwendungen. Commun Biol 5, 1034 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03976-8

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Eingegangen: 30. September 2021

Angenommen: 12. September 2022

Veröffentlicht: 29. September 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03976-8

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