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Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 184 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Tröpfchenmikrofluidik bietet eine Plattform, auf der neue Technologien für digitale molekulare Tests, Krankheitsscreening, Wundheilung und Materialsynthese vorgeschlagen werden. Allerdings sind die aktuellen kommerziellen Tröpfchenerzeugungs-, Montage- und Bildgebungstechnologien zu teuer und zu starr, um eine schnelle und weitreichende Abstimmung der Tröpfchenmerkmale/-ladungen zu ermöglichen. Dieser Rapid-Prototyping-Engpass hat eine weitere Ausweitung seiner Anwendung eingeschränkt. Hier wird ein kostengünstiges, selbst hergestelltes Pipettentröpfchen-Mikrofluidik-Kit vorgestellt. Dieses Kit enthält elliptische Pipettenspitzen, die mit einem einfachen DIY-Werkzeug (Do-It-Yourself) hergestellt werden können, einen einzigartigen bandbasierten oder 3D-gedruckten Bildgebungschip mit flacher Mitte, der eine schnelle Montage/Immobilisierung von Monoschichttröpfchen und Bildgebung mit einem intelligenten System ermöglicht. Handykamera oder Miniaturmikroskop. Die Tröpfchen werden durch manuelles oder automatisches Pipettieren ohne teure und laborgebundene Mikrofluidpumpen erzeugt. Die Tröpfchengröße und die Flüssigkeitsviskosität/Oberflächenspannung können aufgrund unserer speziellen Tröpfchenerzeugungs-, Montage- und Bildgebungsdesigns erheblich variiert werden. Die Vielseitigkeit dieses Rapid-Prototyping-Kits wird anhand von drei repräsentativen Anwendungen demonstriert, die von einer Tröpfchen-Mikrofluidik-Plattform profitieren können: (1) Tröpfchen als Mikroreaktoren für PCR-Reaktionen mit umgekehrter Transkription zum Nachweis und zur Quantifizierung von Ziel-RNAs. (2) Tröpfchen als Mikrokompartimente für die Spirulina-Kultivierung und die optischen Farb-/Trübungsänderungen in Tröpfchen mit Spirulina bestätigen eine erfolgreiche photosynthetische Kultivierung. (3) Tröpfchen als Vorlagen/Formen für die kontrollierte Synthese von Janus-Mikrogelen aus goldbeschichtetem Polyacrylamid/Gold-Komposit. Das einfach herzustellende und benutzerfreundliche tragbare Kit eignet sich daher ideal für Design-, Schulungs- und Bildungslabore.

Die Tröpfchenmikrofluidik hat sich zu einem leistungsstarken Werkzeug für eine Vielzahl multidisziplinärer Anwendungen entwickelt1,2. Zu den spannenden kommerzialisierten und vorgeschlagenen Biotech-Technologien, die auf Tröpfchen-Mikrofluidik basieren, gehören Einzelzelltests3,4, digitale Tröpfchen-PCR5,6, schnelles Krebs-Screening7,8, Arzneimittel- oder Immuntherapie-Screening9,10, Antibiotika-Empfindlichkeits-Screening11, implantierbare Insel-Allotransplantate12,13 usw. Im Allgemeinen Für diese und viele andere Anwendungen werden Tröpfchen typischerweise als Mikroreaktoren, Mikrokompartimente oder Schablonen/Formen verwendet, und eine große Anzahl von ihnen garantiert die einzigartigen Vorteile der Tröpfchen-Mikrofluidik14,15,16,17. Ein gutes Beispiel ist die digitale Tröpfchen-Polymerase-Kettenreaktion (ddPCR), bei der Tröpfchen als Mikroreaktoren verwendet werden6,18. Durch einfaches Aufteilen des PCR-Reaktionsgemischs in viele gleichmäßige Tröpfchen werden die Zielnukleinsäuren gemäß der Poisson-Verteilung in den Tröpfchen verteilt und können anschließend nach der PCR-Amplifikation bis zur Einzelkopieauflösung quantifiziert werden19. Die verbesserte Leistung wird durch eine große Anzahl von Tröpfchen (104–106) verstärkt, was die Einflüsse von Inhibitoren oder Nichtzielen abschwächt und eine absolute Quantifizierung ohne langwierige Erstellung von Standardkurven ermöglicht20,21. Ein weiteres Beispiel ist die Einkapselung von Zellen/Mikroorganismen in Tröpfchen oder aus Tröpfchen gewonnenen Mikrogelen, die zahlreiche Mikrokompartimente mit den richtigen biophysikalischen/biochemischen Mikroumgebungen für Hochdurchsatzuntersuchungen isolierter Einzelzellen und Mikroorganismen versorgen könnten, um groß angelegte Screenings und Optimierungen zu beschleunigen, selbst wenn eine sequentielle Assay-Analyse zulässig ist durch durchlässige Mikrogele13,22,23,24,25,26,27,28. Zusätzlich zu Mikroreaktoren und Mikrokompartimentanwendungen wurden Tröpfchen als Mikrotemplate/Formen für die Synthese weicher und harter Mikro-/Nanomaterialien vorgeschlagen29,30,31. Die kontrollierte Miniaturgröße, die große Oberfläche pro Volumeneinheit, der Einschluss und die große Anzahl der Tröpfchen ermöglichen eine einfache Synthese von Materialien mit den gewünschten Strukturen und Funktionalitäten aufgrund schneller Segregations- und Konzentrationseffekte, die durch einen hohen Hydrophobiegradienten, eine starke Wechselwirkung zwischen Tensid und Oberfläche und Ansammlung hervorgerufen werden Effekte32,33. Die Tröpfchen-Mikrofluidik hat eindeutig mehrere vielversprechende Technologien in zahlreichen Disziplinen inspiriert.

Aktuelle Tröpfchenerzeugungssysteme1,14,34, die häufig hochentwickelte Chips/Geräte und/oder Präzisionsdruckquellen erfordern (die für kommerzielle Tröpfchenerzeugungskits von PreciGenome, Elveflow, Fluigent usw. über fünftausend Dollar kosten), sind jedoch nicht ausreichend einfach , billig und zugänglich, um ein einfaches Prototyping und Training zu ermöglichen, was die breite Implementierung von Tröpfchen-Mikrofluidik-Technologien in interdisziplinären Bereichen und die Weiterentwicklung neuer Technologien zu kommerzialisierbaren Produkten einschränkt. Beispielsweise erfordert die weit verbreitete strömungsfokussierende Tröpfchenerzeugungstechnologie eine Feinabstimmung mit genauer Steuerung von Zweiphasenströmungen in Mikrofluidik-Chips35 und die relativ strömungsratenunempfindliche Stufenemulsionströpfchenerzeugung erfordert normalerweise sorgfältig entworfene Chips/Geräte mit Terrassen36. Neben der gleichmäßigen Tröpfchenerzeugung sollten auch bestehende auf Einschluss basierende Tröpfchenanordnung und mikroskopbasierte Bildgebungsmethoden vereinfacht werden, um zugänglicher und anpassbarer zu sein6,37,38. Daher würde ein einfaches und schnelles Prototyping-Toolkit, das eine abstimmbare mikrofluidische Tröpfchenerzeugungstechnologie sowie robuste Tröpfchenmontage- und Bildgebungsmodule umfasst, die unempfindlich gegenüber Tröpfchengröße und viskoelastischen Eigenschaften sind, eine weitere Ausweitung seiner Anwendungen in interdisziplinären Bereichen ermöglichen – ähnlich wie bei 3D Das Drucken hat sich bei Biochips und anderen Zweigen der Mikrofluidik bewährt39. Zu diesem Zweck wird in dieser Arbeit basierend auf unserer zuvor entwickelten Pipettentröpfchen-Technologie40 ein standardisiertes, umfassendes Pipettentröpfchen-Mikrofluidik-Rapid-Prototyping- und Trainingskit vorgeschlagen, das nicht nur leicht einstellbare Tröpfchenmerkmale, sondern auch robuste und kostengünstige Komponenten ermöglicht, die zusammengebaut, immobilisiert und abgebildet werden können Tröpfchen unterschiedlicher Größe und mit unterschiedlichen rheologischen und Oberflächeneigenschaften. (Abb. 1).

Pipettentröpfchen-Mikrofluidik-Kit: (1) Schematische Darstellung der kontrollierbaren Pipettenspitzenmodifikation durch einen Drehmomentschraubendreher, der zu deformierten kommerziellen Pipettenspitzen mit abgeflachten Kopfteilen führt. Durch die Modifikation wird die ursprüngliche kreisförmige Öffnung der Pipettenspitze in eine elliptische geändert und das Seitenverhältnis der elliptischen Öffnung wird durch die Drehmomentkraft des Schraubendrehers bestimmt. (2) Tröpfchenerzeugung mit den modifizierten Spitzen über einen universellen Mikropipetten. Bei der manuellen Abgabe einer wässrigen Lösung durch eine entsprechend verformte Pipettenspitzenöffnung in fluoriertes Öl werden gleichmäßige Tröpfchen automatisch abgeklemmt. (i, ii, iii) Beispiele typischer Anwendungen der Tröpfchen-Mikrofluidik zu (i) digitaler Tröpfchen-PCR mit Tröpfchen als Mikroreaktoren, (ii) Kultivierung von Spirulina mit Tröpfchen als Mikrokompartimenten und (iii) kontrollierter Synthese von Mikrogelen mit Tröpfchen als Matrizen/ Formen.

Die Vielseitigkeit des robusten Bausatzes ist auf drei Schlüsseltechnologien zurückzuführen, die einfach und schnell hergestellt werden können, um maximale Einstellbarkeit zu ermöglichen. Gleichmäßige Mikrotröpfchen lassen sich bequem durch Pipettieren von Flüssigkeiten aus Pipettenspitzen mit elliptischen Öffnungen für eine bessere Tröpfchenabschnürung erzeugen. Die elliptischen Pipettenspitzen werden hergestellt, indem handelsübliche Pipettenspitzen mit runder Öffnung mit einem DIY-Drehmomentschraubendreher verformt werden. Die Größe der Tröpfchen kann durch einfaches Ändern des Öffnungsseitenverhältnisses der verformten Pipettenspitze angepasst werden. Die Tröpfchen werden durch einen robusten Tröpfchenmontagemechanismus, der auf einem durch Kapillardruck angetriebenen Benetzungsfluss basiert, gepackt und in der flachen Mitte eines leicht herzustellenden doppelseitigen Klebebandchips immobilisiert. Die Tröpfchensuspension nähert sich einer stabilen achsensymmetrischen Geometrie mit einem kreisförmigen Meniskus an und begrenzt die Tröpfchen auf eine konzentrische kreisförmige Monoschicht in der Mitte. Die Tröpfchenbildgebung wird durch die großen und immobilisierten Mikrotröpfchen (300–500 Mikrometer Durchmesser), die mit diesem Kit erzeugt werden, vereinfacht, sodass die Tröpfchen mit Smartphone-Kameras abgebildet oder visuell beobachtet werden können. In Bezug auf die Kosten kostet das DIY-Werkzeug zur Spitzenmodifikation auf Schraubendreherbasis weniger als hundert Dollar, die Gelladespitze weniger als einen Cent pro Spitze, ein Mikropipettierer kostet zwei- oder dreihundert Dollar und der Bildgebungschip besteht aus Glas Die Kosten für einen Objektträger und mehrere Stücke doppelseitiges Klebeband betragen weniger als ein Viertel, und die Bildgebung kann mit einem normalen Hundert-Dollar-Smartphone durchgeführt werden (für die Fluoreszenzbildgebung ist ein Tausend-Dollar-Transilluminator oder ein handliches Fluoreszenzmikroskop erforderlich). Das gesamte Kit für die Tröpfchenerzeugung, -handhabung und -bildgebung (einschließlich Fluoreszenzbildgebung) kann mit zweitausend Dollar realisiert werden, was im Vergleich zu den kommerziellen Kits, die allein für den Teil der Tröpfchenerzeugung über fünftausend Dollar kosten, sehr kostengünstig ist. Darüber hinaus sind Mikropipetten, Pipettenspitzen, Glasobjektträger, doppelseitige Kapton-Polyimid-Bänder gängige Laborverbrauchsmaterialien sowie Drehmomentschraubendreher und Smartphone-Kameras gängige Werkzeuge, was bedeutet, dass das hier vorgeschlagene Pipettentröpfchen-Mikrofluidik-Kit äußerst zugänglich ist. Die Vielseitigkeit des Kits wird anhand von drei Prototyping-Anwendungen der Tröpfchen-Mikrofluidik demonstriert: (i) Tröpfchen als Mikroreaktoren für die digitale Tröpfchen-PCR zum Nachweis und zur Quantifizierung von Ziel-RNAs; (ii) Tröpfchen als Mikrokompartimente für die photosynthetische Kultivierung von Spirulina; (iii) Tröpfchen als Vorlagen/Formen für die kontrollierte Synthese von goldbeschichteten Polyacrylamid/Gold-Komposit-Mikrogelen. Diese typischen Beispiele demonstrieren die Vielseitigkeit und Benutzerfreundlichkeit des Pipettentröpfchen-Mikrofluidik-Kits für die schnelle Prototypenerstellung und Validierung von Tröpfchen-Mikrofluidik-Anwendungen.

Um die Spitzenmodifikation zu standardisieren, wurde eine Reihe von Drehmomentkräften (direkt eingestellt und an einem Drehmomentschraubendreher eingestellt) verwendet, um bestimmte Drücke zu erzeugen, um Pipettenspitzen mit unterschiedlichen elliptischen Öffnungen zu verformen (Abb. 2, „Methoden“: „Elliptische Pipettenspitze“. Weitere Informationen zum Aufbau und zur Verwendung des maßgeschneiderten Werkzeugs für die Spitzenherstellung finden Sie im Abschnitt „Vorbereitung“. Die Beziehung zwischen den Seitenverhältnissen der Spitzenöffnungen und den ausgeübten Drehmomentkräften ist in Abb. 3a dargestellt. Eine Kalibrierungskurve wie diese könnte als Leitfaden für die Herstellung elliptischer Pipettenspitzen mit gewünschten Öffnungsseitenverhältnissen für einen bestimmten Spitzentyp dienen, der unter denselben Bedingungen hergestellt wurde. Das selbstgebaute Werkzeug bietet einen Kanal zum Lokalisieren der Spitzen und die Intervallbarrieren an der Kanalwand helfen dabei, die Länge des verformten Spitzenkopfes zu bestimmen, sodass die Herstellungsbedingungen für elliptische Spitzen besser reproduzierbar sind. (Abb. 2a) Darüber hinaus ermöglicht die Einstellung der verformten Länge (die Länge des verformten Spitzenkopfteils, wie in Abb. 2b rechts dargestellt) auch eine andere Möglichkeit, den Grad der Spitzenverformung abzustimmen (Abb. S1).

Standardisierte Pipettenspitzenmodifikation zur Herstellung von Spitzen mit abgeflachtem Kopf. (a) Das einfache Spitzenverformungswerkzeug lässt sich leicht mit einem 3D-gedruckten Gehäuse, zwei Glas-/Metallschlitten, einer Stahlklemme und einem Drehmomentschraubendreher zusammenbauen. Bei der Anwendung wird eine Pipettenspitze zwischen oder unter die beiden Glas-/Metallobjektträger eingeführt. Die Glas-/Metallschieber können sich nach dem Zusammenbau mit dem 3D-gedruckten Gehäuse nicht frei drehen und übertragen die Drehmomentkraft in Druck, um den Kopfteil der handelsüblichen Pipettenspitze zu verformen. (b) Durch Einstellen des Drehmoments am Drehmomentschraubendreher von null bis zwanzig werden modifizierte Pipettenspitzen (verformte Länge: ~ 3,5 mm) mit unterschiedlichen Verformungsgraden der Kopfteile hergestellt.

Kontrollierte Modifikation der Pipettenspitze durch Änderung der Drehmomentkräfte bei konstanter verformter Länge (~ 3,5 mm) und entsprechender Pipettentröpfchenerzeugung: (a) Querschnitts-Seitenverhältnisse der Pipettenspitzen im Vergleich zum angewendeten Drehmoment für die Spitzenverformung, die verformten Spitzenlängen betragen ~ 3,5 mm, eingeführt Die Bilder zeigen typische Querschnitte deformierter Spitzenöffnungen. (b) durchschnittliche Radien von Wassertröpfchen, die mit durch Drehmoment verformten Pipettenspitzen erzeugt werden. Jeder Punkt stellt den durchschnittlichen Radius und die Standardabweichung (Fehlerbalken) von Tröpfchen dar, die von der entsprechenden deformierten Spitze erzeugt werden, und die eingefügten Bilder sind Tröpfchen, die von den Spitzen mit Öffnungsquerschnitt erzeugt werden Bilder eingefügt in (a). Basierend auf den Kurven können durch Anwendung der entsprechenden Drehmomentkräfte spezifische Spitzen und Tropfen präpariert werden.

Verformte Spitzen mit unterschiedlichen Verformungslängen und/oder unterschiedlichen Drehmomentkräften werden durch Überprüfung der Spitzenöffnungen charakterisiert (Abb. 2b, 3a, S1a,b, S2a,b). Bei gleicher Drehmomentkraft gilt: Je kürzer der Spitzenkopf ist, um den Druck zu verteilen, desto stärker verformt sich der Spitzenkopf (Abb. S1b). Ebenso gilt: Je höher die aufgebrachte Drehmomentkraft, desto stärker verformt sich der Spitzenkopf bei gleicher verformter Länge (Abb. 3a, S2b). Darüber hinaus verhalten sich Spitzen mit unterschiedlichen mechanischen Eigenschaften (aufgrund unterschiedlicher Spitzenmaterialien, Öffnungsabmessungen und Wandstärken usw.) unter dem durch die gleiche Drehmomentkraft verursachten Druck unterschiedlich und verformen sich unterschiedlich (Abb. S3a). Aus diesem Grund sollte für einen neuen Spitzentyp eine entsprechende neue Kalibrierungskurve über ein Standardprotokoll erstellt werden.

Die verformten Pipettenspitzen sind mit einem regulären 20-µL-Pipettengeber zur Tröpfchenerzeugung ausgestattet. Technisch gesehen werden im Tropfmodus bei sehr geringen Durchflussraten gleichmäßige Tröpfchen erzeugt14. Bei deformierten elliptischen Pipettenspitzen kommt es jedoch selbst bei hoher Durchflussrate zu einem automatischen Abklemmen der Tröpfchen, da das Wasser aus dem Quetschhals durch den erhöhten Wasserdruck im Hals abfließt. Dieser erhöhte Druck ist auf die verstärkte Azimutkrümmung am schmalen Ende des elliptischen Querschnitts zurückzuführen. Der erhöhte Halskapillardruck führt zu einer robusteren und schnelleren Erzeugung kleinerer gleichmäßiger Tröpfchen, ähnlich der Stufenemulsionströpfchenerzeugung aus Mikrofluidikchips mit Kanälen mit hohem Seitenverhältnis41, und die Tröpfchenerzeugung ist unempfindlich gegenüber moderaten Änderungen der Flussrate, was das manuelle Pipettieren zur Erzeugung gleichmäßiger Tröpfchen erleichtert Tröpfchen. (Video S1) Wie in den Abbildungen (Abb. 3b, 4, S1c, S2c, S3b, S4) gezeigt, sind die erzeugten Tröpfchen umso kleiner und gleichmäßiger, je höher das Seitenverhältnis der Pipettenspitzenöffnung ist. Ab einem Seitenverhältnis von ~ 3,25 beträgt der Variationskoeffizient (CV) der erzeugten Tröpfchen weniger als 5 % und ab einem Seitenverhältnis von ~ 4 beträgt der Variationskoeffizient der erzeugten Tröpfchen weniger als 2 %. Die Tröpfchengleichmäßigkeit ist vergleichbar mit kommerziellen Tröpfchenerzeugungssystemen, wie z. B. dem Tröpfchenerzeugungspaket Elveflow, das einen Tröpfchen-CV von < 3 % angibt42. Die großen Ungleichmäßigkeiten der Tröpfchen, die mit Spitzen mit niedrigem Öffnungsseitenverhältnis erzeugt werden, haben zwei Gründe. Erstens sind die entsprechenden erzeugten Tröpfchen größer und die größeren Tröpfchen lassen sich während der Tröpfchenerzeugung und -handhabung leicht in kleinere Satellitentröpfchen zerlegen. Zweitens erfordert die Tröpfchenerzeugung mit weniger elliptischen Spitzen geringere Flussraten und ist empfindlicher gegenüber Störungen beim Pipettieren. Der Tröpfchenbereich in Abb. 4 kann durch die Verwendung von Pipettenspitzen unterschiedlicher Öffnungsgröße weiter erweitert werden (Abb. S5).

Wassertröpfchen, die durch eine Reihe deformierter Pipettenspitzen (in dieser Arbeit standardmäßig verwendete 200-µL-Spitzen) mit verschiedenen Spitzenöffnungs-Seitenverhältnissen erzeugt werden. Im Allgemeinen gilt für einen bestimmten Spitzentyp: Je höher das Seitenverhältnis der Spitzenöffnung, desto gleichmäßiger sind die erzeugten Tröpfchen.

Sobald die gleichmäßigen Tröpfchen erzeugt sind, besteht eine weitere Herausforderung beim Prototyping in der Montage und Abbildung der Tröpfchen. Die leichteren Wassertröpfchen tendieren dazu, an die Oberseite der dispergierten Ölphase zu schwimmen und würden sich nicht spontan zu Monoschichten für die Beobachtung zusammenlagern. Darüber hinaus trägt das benetzende Öl die Tröpfchen häufig von der Abbildungsposition weg. Diese Probleme werden typischerweise durch ein kompliziertes geschlossenes Chip-Design mit Säulen und anderen Barrieren gelöst, um Tröpfchen einzuschließen und in Monoschichten zu packen6,37,38. Das Festhalten des Tröpfchens an solchen Barrieren erfordert dann einen anhaltenden Gegendruck, und das Laden wird zu einem großen mikrofluidischen Unterfangen. Außerdem induziert der Kontakt mit den festen Barrieren häufig die Koaleszenz der Tröpfchen und erfordert daher einen präzisen Ladefluss, der auf Tröpfchen unterschiedlicher Größe und Viskoelastizität abgestimmt werden muss.

Das flachzentrierte Design unseres Montagechips ermöglicht eine spontane Montage in der Mitte des Chips und ermöglicht somit das manuelle Laden mit einer Pipette (Abb. 5 und Video S2). Aufgrund der Auswirkung der abfallenden Kanalhöhe auf den Benetzungsölfluss wird die Tröpfchenanordnung auch in der Mitte festgehalten, auch wenn sie kleiner als die Mittenhöhe ist. Die Tröpfchen haben daher nie Kontakt mit der Wand (Abb. 5b, c und Video S2). Um den Kontaktlinienwiderstand zu minimieren, entwickelt sich die Benetzungskontaktlinie nach dem Laden der Tröpfchen-/Ölsuspension von einer unregelmäßigen Form zu einer achsensymmetrischen Form um die flache Mitte. Diese Kontaktlinienausbreitung wird durch die Ausbreitung des benetzenden Öls auf dem Substrat vorangetrieben. Das Festhalten des Suspensionströpfchens in der Mitte ist jedoch auf den Kapillardruck des konkaven Meniskus an der Peripherie der Suspension zurückzuführen. Das benetzende Öl bildet dünne Filme auf dem Substrat, um einen konkaven Meniskus zu erzeugen, der einen negativen Meniskusöldruck relativ zum umgebenden Luftdruck aufrechterhält43,44. Die Größe des Kapillardrucks ist umgekehrt proportional zur Kanalhöhe am Meniskus. Ein radial nach außen gerichteter Vorsprung der Aufhängung führt aufgrund der größeren Kanalhöhe an dieser Position zu einem Meniskus mit einem größeren Krümmungsradius an der Vorsprungsspitze. Dieser größere Meniskusradius führt zu einem weniger negativen Meniskusöldruck und leitet Flüssigkeit vom Vorsprung ab, um das Wachstum des Vorsprungs zu stoppen. Die Ölsuspension nähert sich daher einer radialachsensymmetrischen Form in der Mitte an – sie wird in der flachen Mitte fixiert. Der radiale Fluss während dieser Anpassung an die Achsensymmetrie packt und immobilisiert die Tröpfchen in Richtung der flachen Mitte, um eine kreisförmige Monoschicht abseits der Meniskusperipherie zu bilden. Die Tröpfchen bewegen sich in Richtung der Mitte, weg vom Meniskus an der Peripherie der Suspension, aufgrund der scherinduzierten Migration durch die hohe Scherrate an der sich bewegenden Kontaktlinie und der dort verstärkten hydrophoben Abstoßung durch das Substrat43. Ein Kreis aus zusammengesetzten Tröpfchenmonoschichten ist daher ebenfalls in der flachen Mitte fixiert, konzentrisch zur kreisförmigen Kontaktlinie (Menisken), obwohl die Tröpfchen kleiner als die Spalthöhe in der Mitte sind. Die fixierte Kontaktlinie und die Tröpfchenmonoschicht bleiben stabil, wenn die Spitze wiederholt geneigt wird, und ermöglichen so den Transport zur Bildgebungsanlage. Die Kammerhöhe des sechsschichtigen Bandrahmens ist für den Zusammenbau und die Immobilisierung einer einzelnen Monoschicht von mit der Pipette erzeugten Tröpfchen ausgewählt, was die Bildgebung und Analyse der Tröpfchen vereinfacht. Die Abmessungen des Chips können geändert werden, um Tröpfchen unterschiedlicher Größe und Menge aufzunehmen. Solange Öl den Chip benetzt, der über eine Kammer mit flacher Mitte verfügt, werden die Tröpfchen in der flachen Mitte der Chipkammer festgehalten, um die Abbildung und Handhabung der Tröpfchen zu vereinfachen. Darüber hinaus könnte eine Kerbe an einer Ecke des Bandrahmens geschnitten werden, sodass Pipettenspitzen zur Tröpfchenbeladung in die Mitte der Chipkammer eingeführt werden können, ohne die Abdeckfolie anzuheben (Abb. S6). Was das Entladen der Tröpfchen vom Chip betrifft, handelt es sich lediglich um einen umgekehrten Prozess des Tröpfchenladens (Video S3).

Tröpfchenanordnung und Bildgebungschip aus doppelseitigem Klebeband auf einem Glasobjektträger: (a) Schema des Chips mit einer Spitze an der Ecke, das zeigt, wie Tröpfchen geladen werden; (b) Laden von Tröpfchen in den Chip von einer Ecke durch Anheben der Abdeckfolie; (c) beladene Monoschichttröpfchen, die in der flachen Mitte des Chips für die anschließende Handhabung und Bildgebung immobilisiert werden.

Der Chip mit flacher Mitte kann auch durch 3D-Druck mit einem klaren Harz hergestellt werden, das mit Öl benetzt wird (Abb. 6). Der Chip ist so konzipiert, dass er eine abfallende Höhe von der Wand zur Mitte aufweist, was auch eine Kanalhöhe von etwa 600 Mikrometern wie beim bandbasierten Chip aufweist. Wie erwartet bleiben die zusammengesetzten Tröpfchen während der Handhabung und Bildgebung in der Mitte immobilisiert (Abb. 6c). Ein Problem bei diesem 3D-gedruckten Harzchip besteht darin, dass der Chip die grüne Fluoreszenz blockiert, möglicherweise aufgrund der Initiatorrückstände. Dieses Problem kann gelöst werden, wenn der Chip durch Spritzgießen aus geschmolzenen Polymeren hergestellt wird.

Eine 3D-gedruckte Tröpfchenanordnung und ein Bildgebungschip mit passendem Stecker: (a) das 3D-Modell des Chips und der Querschnitt, um das Design mit flacher Mitte zu zeigen; (b) ein gedruckter Chip; (c) im Chip immobilisierte Monoschichttröpfchen zur anschließenden Handhabung und Bildgebung. Aufgrund der zur Mitte hin abfallenden Innenkammerhöhe bleiben die Tröpfchen von den Wänden im Inneren des Chips fern. Die Außenabmessungen des Tröpfchenbildgebungschips betragen 20 mm × 20 mm × 2,5 mm.

Mit einer ausreichenden Anzahl von Nanoliter-Mikrotröpfchen ist der ddPCR-Nachweis und die Quantifizierung einzelner Nukleinsäuren möglich. Als allgemeines Beispiel wird das humane GAPDH-PCR-Reagenz zum Nachweis und zur Quantifizierung menschlicher RNA verwendet. Dabei wird RNA anstelle von DNA als Ziel gewählt, damit auch die reverse Transkription durchgeführt wird. Das humane GAPDH-PCR-Reagenzienkit wird in Biotechnik-/Biologielabors häufig als grundlegende endogene Kontrolle für die Normalisierung anderer Probennukleinsäuren in quantitativen Echtzeit-Polymerasekettenreaktionstests45,46 eingesetzt. Das preiswerte GAPDH-PCR-Reagenzienkit und die humanen Kontroll-RNAs eignen sich daher ideal für Schulungszwecke. Tröpfchen mit PCR-Reaktionsmischung flocken in normalen PCR-Röhrchen an der Oberseite des dichteren fluorierten Öls aus und neigen dazu, während des Temperaturwechsels zu koaleszieren. Das Problem kann gelöst werden, indem der wässrigen Phase ~ 1 Gew./Vol.-% F127 als Co-Tensid zugesetzt wird.

Für die Fluoreszenzbildgebung von Tröpfchen nach ddPCR werden für dieses Kit zwei Ansätze vorgeschlagen. Die erste besteht darin, die Vorteile einer herkömmlichen Smartphone-Kamera und des Transilluminators zu nutzen, der in Laboren häufig zum Betrachten von Elektrophoresegelen verwendet wird. Da die beim Pipettieren erzeugten Tröpfchen meist mehrere hundert Mikrometer groß sind, sind sie groß genug, um visuell beobachtet und von Smartphone-Kameras abgebildet zu werden. Mit blauer Lichtbeleuchtung und bernsteinfarbener Filterfilterung aus dem Transilluminator kann grüne Fluoreszenz (FAM-Farbstoff) von Tröpfchen aufgezeichnet werden (Abb. 7b). Wenn die Kombination aus Smartphone und Transilluminator nicht praktikabel ist, besteht ein zweiter Ansatz darin, ein kostengünstiges tragbares Fluoreszenz-Minimikroskop zu verwenden (Abb. 7d). Beide Methoden wurden nach der PCR-Reaktion getestet und die positiven Tröpfchen (Tröpfchen mit Zielen, angezeigt durch die verstärkte starke grüne Fluoreszenz) sind in beiden Fällen deutlich erkennbar (Abb. 7). Obwohl das mit dem tragbaren Minimikroskop aufgenommene Tröpfchenfluoreszenzbild einen besseren Kontrast aufweist (Abb. 7d) als das mit der Smartphone-Kamera (Abb. 7b), ist die Anzahl der erkennbaren positiven Tröpfchen bei Bildern aus beiden Ansätzen gleich. Daher stehen zuverlässige und zugängliche Lösungen für die Abbildung der Tröpfchenfluoreszenz nach einer ddPCR-Reaktion zur Verfügung.

Abbildung von ddPCR-Tröpfchen per Smartphone zusammen mit einem Transilluminator ohne (a) oder mit (b) Fluoreszenzbeleuchtung/-filterung und mit einem tragbaren Minimikroskop ohne (c) oder mit (d) Fluoreszenzbeleuchtung/-filterung nach 40 thermischen Zyklen. Die Tröpfchen werden über eine Pipettenspitze erzeugt, die durch eine Drehmomentkraft von 20 Zoll-Pfund verformt wird. Beide Methoden sind ausreichend, um die Tröpfchen richtig abzubilden.

Die effektive Tröpfchenfluoreszenzbildgebung führt zur Quantifizierung der Zielnukleinsäuren. Für Schulungs- und Prototyping-Zwecke erfolgt die Quantifizierung am besten durch Zählen der positiven Tröpfchen, ohne die Gesamtzahl der Tröpfchen zu kennen oder Poisson-Statistiken aufzurufen. Bei niedrigen Kopienzahlen, wenn die Zahl der Tröpfchen die der Ziele deutlich übersteigt, entspricht die Gesamtzahl der positiven Tröpfchen ungefähr der Gesamtzahl der Ziele. Eine positive Tröpfchenquantifizierung erfordert einen vernachlässigbaren Probenverlust während der Tröpfchenerzeugung und Bildgebung. Die pipettierten Nanoliter-Tröpfchen erfüllen alle Anforderungen für die zählbasierte Quantifizierung von Proben mit geringer Zielkonzentration. Wiederholte Experimente werden für mehrere Proben mit niedriger Zielkonzentration (0–1 Pikogramm in 20 µL Reaktionsmischung) durchgeführt und die auf der positiven Tröpfchenzählung basierenden Quantifizierungsergebnisse sind in Tabelle 1 und Abb. 8 dargestellt. Die lineare Beziehung zeigt, dass die Methode korrekt ist ausreichend für eine grobe Quantifizierung und einen genauen Nachweis bei Proben mit geringer Zielkonzentration (Abb. 8). Obwohl die Standardabweichungen mit steigenden Zielkonzentrationen zunehmen, stabilisiert sich der Variationskoeffizient bald im Bereich von 20–30 % (Tabelle 1) und die Variationen werden wahrscheinlich durch Schwankungen der Zielkonzentration in der Probenlösung mit niedriger Konzentration und Volumenschwankungen verursacht Mikropipette und Zielmolekülaffinität zu den Oberflächen des PCR-Röhrchens und der Pipettenspitze. Darüber hinaus beträgt die berechnete Nachweisgrenze47 basierend auf dem durchschnittlichen falsch positiven Ergebnis, der Standardabweichung der Leerproben und der Standardabweichung der Proben mit der niedrigsten nicht negativen Konzentration aus Tabelle 1 (LoD = 0,2 + 1,645 * 0,45 + 1,645 * 1,82 = 3,92) 3,92 Kopie pro 20-µL-Reaktionsmix, was mit kommerziellen ddPCR-Produkten vergleichbar ist und darauf hinweist, dass die Pipetten-ddPCR trotz der zählbasierten Quantifizierung gut für den genauen Nachweis geeignet ist. Aufgrund der Abweichungen von 20–30 % ähnelt sie eher einer groben Schätzung. (Tabelle 1) Obwohl in dieser Demonstration menschliche RNA verwendet wird, kann diese Technik möglicherweise zur Quantifizierung von Virus-RNAs und zur Reduzierung der Falsch-Negativ-Erkennungsrate von PCR-Tests für SARS-CoV-2-Viren in heterogenen Proben eingesetzt werden48,49. Folglich bietet das Kit eine gute Schulung der digitalen Tröpfchen-PCR für den Nachweis und die Quantifizierung von Nukleinsäuren.

Positive Tröpfchenzählung basierende Quantifizierung von Proben mit niedriger Zielkonzentration. Fehlerbalken sind Standardabweichungen.

Mikrotröpfchen bieten isolierte Mikrokompartimente und Mikroumgebungen für Zellen oder Mikroorganismen. Diese Funktion wird aktiv für die Analyse/das Screening einzelner Zellen/Mikroorganismen22,23,24,25 und auch für neu entstehende Tröpfchen-/Zellfabriken50,51 genutzt. Für viele dieser Anwendungen bieten die Tröpfchen eine unverzichtbare Manipulation und Untersuchung einzelner Zellen oder Mikroorganismen. Um beispielsweise die Tröpfchenverkapselung mit unserem vorgeschlagenen Kit zu zeigen, wird ein einzelner Mikroorganismus Spirulina in kleinen und großen Mikrotröpfchen in bandbasierten Bildgebungschips (Abb. 9) oder PCR-Röhrchen (Abb. S7) kultiviert. Spirulina ist eine Art essbarer Cyanobakterien mit hervorragender Photosyntheseeffizienz, die eine Vielzahl von Nährstoffen und Inhaltsstoffen für Tiere und Menschen produziert. Das photosynthetische Wachstum von Spirulina ist kräftig, da die hohe O2/CO2-Löslichkeit (10–20 × höher als in Wasser) in fluoriertem Öl die Vermehrung von Mikroorganismen unterstützt52,53. Mit der Zeit nimmt die Zahl der Spirulina zu und nimmt schließlich das gesamte Tröpfchen ein (Abb. 9, S7). Nach 10 Tagen Kultivierung beträgt die berechnete Proliferationsrate (Anzahl der Tröpfchen mit mindestens vier Spirulina-Kopien / Gesamtzahl der Tröpfchen mit Spirulina) aus sechs Experimenten 96,9 ± 1,8 %. Das Wachstum von Spirulina in kleineren Mikrotröpfchen verläuft relativ langsamer, wahrscheinlich aufgrund des begrenzteren Platzangebots und der geringeren Nährstoffversorgung. (Abb. 9a–d, i, j) Der Einschluss der Tröpfchen ist wirksam, und es ist nicht zu beobachten, dass Spirulina diffundiert oder in andere Tröpfchen übergeht (Abb. 9c, g, j, l). Darüber hinaus isoliert und schützt der Einschluss der Tröpfchen die Spirulina durch die Kraft/Weichwände (Tröpfchen/Öl-Grenzflächen), die mit biokompatiblen Tensiden gebildet werden54. Obwohl die Tröpfchen nach Tagen des photosynthetischen Wachstums aufgrund der Wasserverdunstung schrumpfen können, sind die von der Pipette erzeugten großen Mikrotröpfchen immer noch groß genug für die Smartphone-Bildgebung und das anhaltende Wachstum bedeutet, dass Spirulina-Mikroorganismen über 10 Tage lang am Leben sind (Abb. 9e–h, S7). Die Farb- oder Trübungsunterschiede, die durch die vermehrte Spirulina in positiven Tröpfchen verursacht werden, bestätigen eine erfolgreiche Kultivierung und implizieren eine digitale Quantifizierung von Mikroorganismenproben mit geringer Konzentration nach ordnungsgemäßer Kultivierung, wie sie beispielsweise für die digitale Quantifizierung von Bakterientröpfchen berichtet werden55.

Photosynthetische Kultivierung von Spirulina in kleinen (a–d) und großen (e–h) Mikrotröpfchen in bandbasierten Bildgebungschips: (a,e) Spirulina in so erzeugten Tröpfchen; (b,f) vermehrte Spirulina in positiven Tröpfchen nach 5 Tagen Kultivierung; (c, g) vermehrte Spirulina in positiven Tröpfchen nach 10 Tagen Kultivierung; (d,h) Smartphone-Bildgebung der 10-Tage-Kultivierungströpfchen, die erkennbare Farb-/Trübungsunterschiede positiver Tröpfchen mit Spirulina zeigt, insbesondere bei großen Mikrotröpfchen; (i–l) Bilder mit geringer Vergrößerung entsprechend (a,c,e,g).

Intuitiv sind Tröpfchen hervorragende Vorlagen/Formen für die Mikrogelsynthese. Mit Beginn der Vernetzung werden die Flüssigkeitströpfchen mit Acrylamid-Polymerisationsvorläufern in einheitliche Mikrogele umgewandelt (Abb. 10a–d). Die Umwandlung von Flüssigkeit in Gel in Tröpfchen wird weiter genutzt, um Polyacrylamid/Gold-Komposit-Mikrogele mit Goldkappen zu synthetisieren (Abb. 10e – h). Die Idee besteht darin, die unterschiedlichen kinetischen Zeitskalen der Gelierungs-/Fällungsreaktionen und die unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften ihrer Produkte zu nutzen, um die synthetisierten Materialien zu strukturieren. Im Allgemeinen hat das Gelnetzwerk einen Eingrenzungseffekt auf die innere Synthesereaktion, der nicht nur die Sedimentation von Niederschlägen verhindert, sondern auch eine Oberflächenadsorption/-reaktion einleitet, um Materialien mit unterschiedlichen Strukturen/Morphologien zu produzieren. Beispielsweise wurden unterschiedliche Kristallstrukturen in großen Flüssigkeits- und Gelnetzwerken genutzt, um strukturierte Einkristalle durch programmierbaren Einbau von Fremdmaterialien zu synthetisieren56. Dabei wird der Acrylamid-Gelierungsvorläufer mit 100 mM Natriumcitrat und 50 mM Gold(III)-chlorid gemischt und diese Lösung bleibt etwa 6 Minuten lang stabil, bevor eine merkliche Goldreduktion auftritt. Der Zeitraum von 6 Minuten reicht für die Pipettentröpfchenerzeugung der 20-µL-Mischung aus, die normalerweise etwa 3 Minuten dauert. Die Goldreduktion in so erzeugten Flüssigphasentröpfchen erfolgt schnell und eine gute Menge an reduziertem Gold fällt etwa 10 Minuten nach der Tröpfchenerzeugung am Boden jedes Tröpfchens aus (Abb. 10e, f). Bei 2-minütiger UV-Bestrahlung werden Flüssigkeitströpfchen polymerisiert und zu Mikrogelen vernetzt, während das zuvor ausgefällte Gold in der unteren Hemisphäre eingefangen wird, um Goldkappen auf den Mikrogelen zu bilden (Abb. 10g, h). Nach den Störungen (Rotation und Bewegung), die durch nachfolgende Manipulationen für die Bildgebung verursacht werden, sind die Goldkappen zufällig ausgerichtet (Abb. 10h), was auf die Bildung von Mikrogelen hinweist, da sonst alle Goldlücken wie in der vorvernetzenden Flüssigkeit auf den Boden fallen Tröpfchen (Abb. 10f). Darüber hinaus verschmilzt das neu reduzierte Gold, möglicherweise aufgrund der Einschluss- und Goldreduktionseffekte durch die In-situ-Bildung des Polyacrylamidnetzwerks,57 bei der Gelierung sofort zu Goldnanopartikeln in den Gelnetzwerknanoporen des Mikrogels, was durch die klassische weinrote Farbe von angezeigt wird die Mikrogele (Abb. 10g). Dieses Beispiel einer kontrollierten Synthese von verkappten Polyacrylamid/Gold-Komposit-Mikrogelen zeigt, dass Tröpfchen vielversprechende Formen und Vorlagen für die Synthese funktional strukturierter Mikrogele oder Partikel mit gewünschten Strukturen und Zusammensetzungen sind33,58.

Kontrollierte Synthese von Mikrogelen: (a–d) Smartphone- (a,c) und Mikroskop- (b,d) Bilder von zwei Größen von Polyacrylamid-Mikrogelen, hergestellt aus 20-µL-Mischungen mit verschiedenen Pipettenspitzen. (e,f) Tröpfchen mit Gelierungsvorläufern und Goldreduktionsquellen vor der Gelierung. In den Tröpfchen der flüssigen Phase fällt das reduzierte Gold aufgrund seiner höheren Dichte am Boden der Tröpfchen aus. Die Tröpfchen werden UV-vernetzt, um die verkappten Polyacrylamid/Gold-Komposit-Mikrogele in (g,h) zu synthetisieren. Der UV-Gelierungsprozess wird auch die Goldreduktion beschleunigen und das in situ gebildete Polyacrylamidnetzwerk begrenzt das Wachstum von reduziertem Gold, um (g) weinrote Mikrogele zu erzeugen, die mit Goldnanopartikeln gefüllt sind. Zuvor ausgefälltes Gold am Boden jedes Flüssigkeitströpfchens wird an Ort und Stelle fixiert, um schließlich (h) Mikrogele mit Goldkappen herzustellen. Bilder von (a,c,e,g) werden mit dem Smartphone aufgenommen, während Bilder von (b,d,f,h) mit einem Tischmikroskop aufgenommen werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit ein selbstgemachtes Rapid-Prototyping-Kit für die Tröpfchen-Mikrofluidik bereitgestellt hat, das von Anfängern und Laienforschern mit unterschiedlichem Hintergrund verwendet werden kann. Der anspruchsvolle und knifflige Tröpfchen-Mikrofluidik-Arbeitsablauf der Tröpfchenerzeugung/-montage/-bildgebung, der oft teure kommerzielle Geräte erfordert, die schwer abzustimmen sind, wird durch die Pipettentröpfchenerzeugung mit einfach herzustellenden elliptischen Pipettenspitzen, die Tröpfchenmontage und die Immobilisierung im Chip mit flacher Mitte vereinfacht ( hergestellt mit Bändern oder 3D-Druck) und Tröpfchenbildgebung per Smartphone oder tragbarem Minimikroskop. Diese Designs ermöglichen die einfache Erzeugung gleichmäßiger Tröpfchen unterschiedlicher Größe und einer dispergierten Flüssigkeit mit beliebiger Viskosität, Oberflächenspannung und Zellgehalt. Drei Beispiele werden ausgewählt und durchgeführt, um die vielseitigen Anwendungen dieser Tröpfchen-Mikrofluidik-Plattform auf einzelne Moleküle, einzelne Mikroorganismen und die Materialsynthese zu demonstrieren, wobei Tröpfchen als Mikroreaktoren, Mikrokompartimente bzw. Vorlagen/Formen verwendet werden: (i) digitale Tröpfchen-PCR-Reaktion in Tröpfchen zur Quantifizierung RNAs mit geringer Kopienzahl am Ort des Bedarfs ohne den Kauf teurer Instrumente; (ii) photosynthetische Spirulina-Kultivierung in Tröpfchen; (iii) kontrollierte Synthese von verkappten Polyacrylamid/Gold-Komposit-Mikrogelen. Obwohl die drei Beispiele nicht im Detail untersucht werden, haben wir gezeigt, dass das Kit zur Unterstützung umfangreicher Rapid Prototyping- und Testverfahren verwendet werden kann. Daher sollte das Pipetten-Tropfen-Kit das Design, die Prototypenerstellung und die Personalschulung von Tröpfchen-Mikrofluidik-Technologien durch nicht fachkundige Benutzer erleichtern.

Um den Prozess der Spitzenmodifikation zu standardisieren, wird ein Werkzeug auf der Basis eines Drehmomentschraubendrehers zusammengestellt. Grundsätzlich wandelt das Werkzeug die Drehmomentkräfte in Drücke um, um die Pipettenspitzen zu verformen. Eine Metallklammer wird mit einem 3D-gedruckten Gehäuse kombiniert, das die Drehung von Glas-/Metallobjektträgern und die Bewegung von Pipettenspitzen während der Verformung verhindert. Eine Modelldatei des 3D-gedruckten Gehäuses finden Sie in den Hintergrundinformationen.

Zur Vorbereitung einer elliptischen Pipettenspitze wird der Kopfteil einer regulären Spitze mit runder Öffnung (Fisherbrand™ Gel-Loading Tips, 1–200 μL, in dieser Arbeit verwendete Standardspitzen, sofern nicht anders angegeben) zwischen oder unter die beiden Gläser eingeführt /Metallschlitten am Spitzenmodifikationswerkzeug montiert. Der Kanal auf dem 3D-gedruckten Gehäuse hilft dabei, die Spitzen zu lokalisieren, und die Intervallbarrieren an den Kanalwänden helfen dabei, zu bestimmen, wie lange die Spitze zur Verformung eingeführt wird, sodass die Spitzen auf besser kontrollierbare und reproduzierbare Weise verformt werden. Am Drehmomentschraubendreher wird direkt eine bestimmte Drehmomentkraft eingestellt und mit dem Schraubendreher die Schraube an der Metallschelle so weit eingedreht, bis das gewünschte Drehmoment erreicht ist. Nach zehn Sekunden wird das Drehmoment aufgehoben und die deformierte Spitze entfernt. Während der Schraubendreher die Spitze zusammendrückt, können sich die Glas-/Metallschieber im 3D-gedruckten Gehäuse nicht frei drehen und daher das Drehmoment in Druck umwandeln, um den Kopfteil der Pipettenspitze in den gewünschten elliptischen Querschnitt zu verformen. Die starren Glasobjektträger brechen, wenn die Drehmomentkraft über 20 Zoll-Pfund liegt, und stärkere Metall- oder andere Materialobjektträger/-platten können verwendet werden, um Spitzen bei höheren Verformungsdrehmomentkräften zu verformen.

Zur Messung der Seitenverhältnisse der Spitzenöffnungen werden etwa 2 mm lange Stücke der Öffnung mit neuen Rasierklingen von den gekauften oder verformten Spitzen abgeschnitten und die abgeschnittenen Stücke vertikal auf doppelseitiges Polyimid-Kapton-Band geklebt, wobei bereits eine Bandseite vorhanden ist an einem normalen Glasobjektträger befestigt. Zur einfacheren Bildgebung stehen die ursprünglichen Spitzenöffnungsflächen in Kontakt mit der Bandoberfläche. Anschließend werden die Spitzenöffnungen auf dem Objektträger mit einem Mikroskop (Olympus IX71) abgebildet und die beiden Achsen (lang und kurz) der Öffnungen durch zwei orthogonale Koordinationsliniensegmente in Adobe Illustrator gemessen (Abb. S8). Kurz gesagt, für ein Spitzenöffnungsbild wird eine Linie gezeichnet, um die Längsachse anzuzeigen, und dann wird die Linie an Ort und Stelle kopiert und um 90° gedreht. Die kopierte und gedrehte Linie wird an die Länge der kurzen Achse der Öffnung angepasst (nur die Länge wird geändert, keine Drehung oder Verschiebung der Linie, sodass die Linien der langen und kurzen Achse senkrecht zueinander stehen und sich im Mittelpunkt schneiden der Längsachse). Schließlich werden die Längen der beiden Linien aufgezeichnet und zur Berechnung des Seitenverhältnisses verwendet, nämlich (Länge der langen Achse)/(Länge der kurzen Achse).

Die Pipettenspitze mit abgeflachtem Kopf wird an einer normalen 20-µL-Mikropipette befestigt. Anschließend werden ~ 10 µL fluoriertes Öl (HFE 7500 mit 2 Gew.-% RAN-008 Tensid, RAN Biotechnologies) in die Pipettenspitze angesaugt und anschließend aus der Spitze in ein 200 µL PCR-Röhrchen (Cole-Parmer, Art.-Nr. EW) pipettiert -67103-90), vorbeladen mit 40–50 µL fluoriertem Öl. Die Pipettenspitze wird etwa 50 s lang an der Luft getrocknet. Anschließend wird mit der Mikropipette mit der verformten Spitze die Probenflüssigkeit angesaugt. Die Pipettenspitze mit Probenflüssigkeit wird in die vorbeladenen 40–50 µL fluoriertes Öl im 200 µL PCR-Röhrchen eingeführt. Nach einigen Sekunden benetzt das Öl die Innenseite und die Oberfläche der Spitzenöffnung. In manchen Fällen (z. B. bei viskosen Probenflüssigkeiten, stark verformten Spitzen usw.) benetzt das Öl den Spitzenkopf nur wenig, wäre es hilfreich, den Mikropipettierer nach hinten zu verstellen, um das Volumen um 0,5–1 µL zu erhöhen, um das Öl in den Spitzenkopf zu befördern und befeuchten Sie die Innenflächen der Spitze. Nachdem der Spitzenkopf mit Öl benetzt wurde, wird die Probenflüssigkeit in der Spitze langsam in das Öl hineinpipettiert, um eine automatische Abschnürung in gleichmäßige Tröpfchen zu erreichen. Die empfohlene Pipettierflussrate beträgt weniger als 10 µL/min. Da die Tröpfchenerzeugung nicht empfindlich auf kleine Änderungen der Flussrate reagiert, ist manuelles Pipettieren zur Tröpfchenerzeugung bei elliptischen Spitzen mit hohem Aspektverhältnis möglich. Für die automatisierte Pipettiertröpfchenerzeugung wird jedoch ein elektrischer Mikropipettor mit kontrollierter Flussrate empfohlen.

Unser einzigartiger Chip mit flacher Mitte besteht aus sechs Schichten gewöhnlichem doppelseitigem Polyimidband auf einem Glasobjektträger und die Oberseite ist mit einem Stück der Bandschutzfolie (Bandauskleidung) bedeckt, nachdem aus dem geschichteten Band eine Kammer für Tröpfchen herausgeschnitten wurde Wird geladen. Beim Platzieren der Bandschutzfolie (die ursprünglich mit dem Band in Berührung kommende Folienseite zeigt nach unten und wird später am Bandrahmen befestigt) wird die durchsichtige Folie in der Mitte des Bandrahmens einfach mit dem Daumen auf die Glasgleitfläche gedrückt und dann Der Rand der durchsichtigen Folie ist fest mit dem Bandrahmen verklebt. Da der durchsichtige Film in der Mitte beim Abdecken nach unten gedrückt wird, obwohl der Film nach dem Nachlassen des Drucks ein wenig zurückspringt, wird der Spalt zwischen dem Film und dem Objektträger in der Mitte des Bandchips enger (Abb. S9). Es wird empfohlen, die Folie sowohl in der Mitte fest gegen die Glasgleitfläche als auch mit der Schürze an den Bandrahmen zu drücken, um den Mittelspalt so schmal wie möglich zu machen, insbesondere bei nicht mit Klebeband versehenen Rahmen, sodass auch nach dem Anheben des Konnektors eine flache Mitte vorhanden ist während des Ladens der Probe hoch. Sobald es eine flache Mitte gibt, ist die sehr genaue Steuerung der schmalen Spalthöhe nicht erforderlich. Vor dem Laden der Proben könnte die reine Ölphase zum Testen des Chips verwendet werden, um sicherzustellen, dass die flache Mitte das Öl in der Mittelbohrung stabilisieren kann. Wenn die Ölphase zu den Wänden des Bandrahmens schwimmt, entfernen Sie das Öl und wiederholen Sie den Schritt zum Abdecken/Befestigen der Folie oder fertigen Sie einen neuen Chip an, wenn der Bandrahmen nicht mehr klebt. Die Abmessung des Chips ist recht flexibel und für den Anfang wird ein Chip mit einem 75 mm x 50 mm großen Glasobjektiv, einem äußeren 50 mm x 50 mm großen und einem inneren 30 mm x 30 mm großen Bandrahmen und einer 56 mm x 56 mm großen Abdeckfolie empfohlen Versuche (Abb. 5a). Wie bereits erwähnt, beträgt die Spalthöhe in der Mitte für sechsschichtige, bandbasierte Chips etwa 600 Mikrometer, was anhand der Außendurchmesser (OD) bestimmter Pipettenspitzen wie der Spitze mit 0,57 mm AD, die in dieser Arbeit für die Tröpfchenbeladung verwendet wird, grob abgeschätzt werden kann . Für kleinere Tröpfchen kann eine gewisse Anpassung der reduzierten Mittenhöhe der Kammer durch die Verwendung weniger Klebebandschichten erforderlich sein. Der Chip ist wiederverwendbar, bis der Bandrahmen nicht mehr ausreichend haftend ist, um eine flache Mittelkammerstruktur aufrechtzuerhalten. Für haltbarere Chips wird doppelseitiges Superklebeband empfohlen. Zwei Schichten teurer PCR-Rahmenversiegelungskammer (Bio-Rad, 15 × 15 mm, 65 µL #SLF0601) könnten stattdessen zur Herstellung des Bildgebungschips verwendet werden, wenn das Herausschneiden einer Kammer aus dem sechsschichtigen Polyimidband ein Problem darstellt.

Der Baugruppenchip mit flacher Mitte kann auch 3D-gedruckt werden, anstatt mit der oben beschriebenen Klebebandmethode hergestellt zu werden. Der Chip wurde mit einer kostenlosen Online-Software (Tinkercad) entworfen und mit einem günstigen, beliebten Harz-3D-Drucker (ELEGOO Mars 2 Pro) mit einem klaren Harz (Siraya Tech Blu 3D Printer Resin Clear V2) gedruckt. Das 3D-Modell wird von einer kostenlosen Software (CHITUBOX Basic) mit 4 s Belichtungszeit, 40 s Bodenbelichtungszeit, Hubabstand 8 mm, 50 µm Druckschichthöhe, Hubgeschwindigkeit 80 mm/min und Rückzugsgeschwindigkeit 210 mm/min geschnitten . Nach dem Drucken wird der Chip mit 25–50 %iger Harzlösung in Isopropylalkohol (IPA) gewaschen. Reines IPA-Waschen wird nicht empfohlen, da dadurch der unvollständig vernetzte Chip übermäßig gereinigt wird und die Chipoberflächen rau und weniger transparent werden. Der saubere Chip wird vor der Verwendung viermal bei 5-minütiger Belichtung in einer Härtungsbox (ELEGOO Mercury Plus 2 in 1 Wasch- und Härtungsstation V2.0) UV-gehärtet.

Eine handelsübliche Pipettenspitze mit runder Öffnung (VWR® Gel-Loading Pipet Tips, 1–200 µL, runde Spitze, 0,57 mm Außendurchmesser) wird zum Absaugen der Tröpfchen-/Ölsuspension aus dem Behälter verwendet. Anschließend gibt die Pipette die Suspension durch eine Ecke des Klebefolienchips in die Mitte des Bildgebungschips ab, indem sie die Abdeckfolie an dieser Ecke leicht anhebt (siehe Video in den Hintergrundinformationen). Alternativ kann an einer Ecke eine Kerbe aus dem Bandrahmen geschnitten werden, um die Spitze durch die Kerbe in die Mitte des Bildchips einzuführen, ohne die Abdeckfolie anzuheben. Für den gleichen Zweck wird ein Pipetteneinlass für den 3D-gedruckten Chip hergestellt. Aufgrund der flachen Mittelstruktur (geringere Höhe) fließt die Suspension trotz des benetzenden Öls nicht frei. Stattdessen wird es in der Mitte des Bildgebungschips befestigt, um eine bequeme optische Bildgebung durch ein Smartphone (OnePlus 7 Pro) oder ein Mikroskop (Olympus IX71) zu ermöglichen. Mikroskopbilder werden zur Analyse der Tröpfchengröße und -einheitlichkeit verwendet, um die Leistung der Pipettentröpfchenerzeugung zu validieren. Kurz gesagt wird in ImageJ eine Skala entsprechend der Maßstabsleiste des Mikroskops festgelegt und dann werden die Projektionsflächen einzelner Tröpfchen gemessen, um den Radius jedes Tröpfchens zu berechnen. Da die Höhe der Kammer des Bildgebungschips etwa 600 µm beträgt, können sich Tröpfchen, die größer sind als diese, etwas abflachen, wenn sie in den Bildgebungschip geladen und zusammengesetzt werden, wodurch größere Projektionsflächen und folglich größere Radien als normal entstehen.

Für die Fluoreszenzbildgebung wird der Chip mit den Tröpfchen auf einen Blaulicht-Transilluminator (Clare Chemical Research) gelegt und dann ein bernsteinfarbener Filter auf den Bildgebungschip gelegt. Die Fluoreszenz von Tröpfchen wird mit einem Smartphone bei schwacher oder dunkler Umgebung abgebildet, nachdem der Transilluminator eingeschaltet wurde. Wenn kein Transilluminator verfügbar ist, wird für die Tröpfchenbildgebung ein erschwingliches tragbares Mini-Fluoreszenzmikroskop (Dino-Lite AM4115T-GFBW) empfohlen.

Ein typischer Reaktionsmix wird mit 5 µL Luna Probe One-Step RT-qPCR 4X Mix (New England Biolabs, Katalog-Nr. M3019S), 1 µL humanen GAPDH-Primern und -Sonden (Thermo Fisher Scientific, Katalog-Nr. 4333764 T) und 2 µL 10 hergestellt w/v % wässrige F127-Lösung, 0–10 µL verdünnte menschliche Kontroll-RNA (Thermo Fisher Scientific, Katalog-Nr. 4.307.281) als Ziel und 12–2 µL nukleasefreies Wasser, um ein Gesamtmischungsvolumen von 20 µL zu erreichen. Die gefrorenen Reagenzien werden vor der Verwendung auf Eis geschmolzen und durch Pipettieren gemischt und unmittelbar nach der Verwendung wieder in den Kühlschrank gestellt. Die wässrige Lösung mit 10 Gew./Vol.-% F127 wird durch Auflösen von 0,1 g F127-Pulver (Sigma-Aldrich, BioReagent, Katalog-Nr. P2443-250G) in 1 ml kaltem, nukleasefreiem Wasser (Thermo Fisher Scientific, Katalog-Nr. R0582) hergestellt Die Lösung wird bei 4 °C gelagert. Sobald die Reaktionsmischung fertig ist, werden, wie bereits erwähnt, gleichmäßige Tröpfchen in den PCR-Röhrchen erzeugt. Das PCR-Röhrchen mit den Tröpfchen der Reaktionsmischung wird sofort in einen tragbaren Thermocycler (Bio-Rad, MJ Mini Thermal Cycler) für die PCR-Reaktion mit einem Protokoll von 10 Min. Reverse Transkription bei 52 °C, 2 Min. Denaturierung bei 95 °C, 40 °C gegeben Zyklen von 10 s bei 95 °C und 30 s bei 60 °C.

Die Spirulina (ACAp-01003) und das entsprechende komplette Kulturmedienset (Salze + Nährstoffe, MKAp-00001) stammen von Algae Research Supply. Das Nährmedium wird durch Auflösen der Salze und Nährstoffe in einer bestimmten, vom Lieferanten empfohlenen Menge Wasser hergestellt. Die Spirulina-Suspension wird dann mit dem Kulturmedium auf die gewünschten Konzentrationen verdünnt. Die gut gemischte Spirulina und das Kulturmedium werden durch Pipettieren der Tröpfchenerzeugung mit einer elliptischen Spitze, die durch eine Drehmomentkraft von 20 Zoll-Pfund verformt wird, in Tröpfchen dispergiert. Nach dem Einkapseln des Mikroorganismus werden die Tröpfchen (zusammen mit dem Tröpfchenerzeugungsöl in doppelseitige, auf Klebeband basierende Bildgebungschips oder in 200-µL-PCR-Röhrchen geladen) auf eine Fensterbank mit Sonnenlicht gelegt, um das Wachstum und die Vermehrung von Spirulina zu ermöglichen. Die Ecke des Bildgebungschips und der Deckel des PCR-Röhrchens werden zum Zweck des Gasaustauschs während der Spirulina-Kultivierung in Tröpfchen einmal täglich für etwa 1 Minute geöffnet. Unter diesen Bedingungen beträgt der Lebenszyklus von Spirulina 2–3 Wochen.

Zur Herstellung von Polyacrylamid-Mikrogelen werden 5 µL Monomer- und Vernetzerlösung (Acrylamid: Bis-Acrylamid 29:1, 40 % Lösung, Fisher BioReagents, BP1408-1) mit 13 µL entionisiertem Wasser und 2 µL 2 w/v % Initiatorlösung gemischt . Die 2 w/v %ige Initiatorlösung wird hergestellt, indem 10 mg Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat-Pulver (LAP, Sigma-Aldrich, 900,889-1G) in 500 µL Wasser gelöst werden und das die Lösung enthaltende Röhrchen mit einem Aluminium umwickelt wird Folie abdecken und bei Nichtgebrauch im Dunkeln aufbewahren. Die resultierende 20-µL-Vorläufermischung wird durch Pipettieren mit einer elliptischen Spitze, die durch eine Drehmomentkraft von 20 Zoll-Pfund verformt wird, zu Tröpfchen geformt. Neben dieser Pipettenspitze wird auch ein anderer Spitzentyp (Eppendorf Microloader-Spitze) mit reduzierter Öffnungsgröße durch die gleiche Kraft verformt und zur Erzeugung kleinerer Tröpfchen verwendet. Die erzeugten Tröpfchen werden nach 2-minütiger Bestrahlung in einer UV-Box (Electro-Lite, Electro-Cure 500) in gleichmäßige Mikrogele umgewandelt.

Für die kontrollierte Synthese von Polyacrylamid/Gold-Komposit-Mikrogelen mit Goldkappen wird die Lösung mit 10 µL Wasser, 5 µL Monomer und Vernetzerlösung (Acrylamid: Bis-Acrylamid 29:1, 40 % Lösung, Fisher BioReagents, BP1408-1) hergestellt ), 2 µL 2 w/v % LAP-Initiatorlösung, 2 µL 1 M Natriumcitrat-Lösung (Sigma-Aldrich, W302600-1 KG-K) und 1 µL 1 M Goldchlorid-Lösung (Sigma-Aldrich, 520,918-1G). Nach dem gründlichen Mischen wird die Lösung durch Pipettieren mit einer elliptischen Spitze, die durch eine Drehmomentkraft von 20 Zoll-Pfund verformt wird, sofort zu Tröpfchen geformt. Das neu reduzierte Gold fällt am Boden jedes Tropfens aus. Zehn Minuten später werden die Tröpfchen zu Mikrogelen vernetzt, indem sie für 2 Minuten in eine UV-Box gelegt werden. Der Gelierungsprozess fixiert das ausgefällte Gold und bildet Kappen auf den einheitlichen Mikrogelen.

Die Autoren erklären, dass alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, im Papier und in den Zusatzinformationen verfügbar sind.

Shang, L., Cheng, Y. & Zhao, Y. Emerging Droplet Microfluidics. Chem. Rev. 117, 7964–8040 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, DA & van Oijen, AM Tröpfchen-Mikrofluidik: Ein Werkzeug für Biologie, Chemie und Nanotechnologie. TrAC, Trends Anal. Chem. 82, 118–125 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Hosokawa, M., Nishikawa, Y., Kogawa, M. & Takeyama, H. Massiv parallele Amplifikation des gesamten Genoms für die Einzelzellsequenzierung mithilfe von Tröpfchenmikrofluidik. Wissenschaft. Rep. 7, 1–11 (2017).

Artikel Google Scholar

Gao, C., Zhang, M. & Chen, L. Der Vergleich zweier Einzelzell-Sequenzierungsplattformen: BD Rhapsody und 10x Genomics Chromium. Curr. Genomics 21, 602–609 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D. & Žel, J. Multiplex-Quantifizierung von vier DNA-Zielen in einer Reaktion mit dem digitalen Bio-Rad-Tröpfchen-PCR-System für den GMO-Nachweis. Wissenschaft. Rep. 6, 1–9 (2016).

Artikel Google Scholar

Madic, J. et al. Digitale Dreifarben-Kristall-PCR. Biomol. Erkennen. Quantif. 10, 34–46 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Rima, XY et al. Mikrofluidische Gewinnung extrazellulärer Vesikel aus Brustkrebstumorsphäroiden aus immobilisierten Mikrogelen für die Analyse einzelner Vesikel. Labor auf einem Chip (2022).

Wang, Y. et al. Funktionelles Hochdurchsatz-Screening für die Krebsimmuntherapie der nächsten Generation mithilfe tröpfchenbasierter Mikrofluidik. Wissenschaft. Adv. 7, eabe3839 (2021).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Ding, S. et al. Vom Patienten stammende Mikroorganosphären ermöglichen klinische Präzisionsonkologie. Cell Stem Cell 29(6), 905–917 (2022).

Artikel CAS Google Scholar

Wong, AH-H. et al. Arzneimittelscreening von Krebszelllinien und menschlichen Primärtumoren mittels Tröpfchen-Mikrofluidik. Wissenschaft. Rep. 7, 1–15 (2017).

Artikel ADS Google Scholar

Postek, W. & Garstecki, P. Tröpfchenmikrofluidik für die Hochdurchsatzanalyse der Antibiotikaanfälligkeit in Bakterienzellen und -populationen. Acc. Chem. Res. 55, 605–615 (2022).

Artikel CAS Google Scholar

Lei, J. et al. FasL-Mikrogele induzieren die Immunakzeptanz von Insel-Allotransplantaten bei nichtmenschlichen Primaten. Wissenschaft. Adv. 8, 9eabm881 (2022).

Artikel Google Scholar

Pan, Z. et al. Konforme Einzelzellen-Hydrogelbeschichtung mit elektrisch induzierter Spitzenströmung eines AC-Kegels. Biomaterial. Wissenschaft. 9, 3284–3292 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Zhu, P. & Wang, L. Passive und aktive Tröpfchenerzeugung mit Mikrofluidik: eine Übersicht. Lab Chip 17, 34–75 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Günther, A. & Jensen, KF Mehrphasen-Mikrofluidik: Von Strömungseigenschaften bis hin zur Chemie- und Materialsynthese. Lab Chip 6, 1487–1503 (2006).

Artikel Google Scholar

Pan, Z., Men, Y., Senapati, S. & Chang, H.-C. Eingetauchtes Wechselstrom-Elektrospray (iACE) zur Erzeugung monodisperser wässriger Tröpfchen. Biomicrofluidics 12, 044113 (2018).

Artikel Google Scholar

Teh, S.-Y., Lin, R., Hung, L.-H. & Lee, AP Tröpfchen-Mikrofluidik. Lab Chip 8, 198–220 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Hindson, BJ et al. Digitales Tröpfchen-PCR-System mit hohem Durchsatz zur absoluten Quantifizierung der DNA-Kopienzahl. Anal. Chem. 83, 8604–8610 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Pinheiro, L. & Emslie, KR Grundkonzepte und Validierung digitaler PCR-Messungen. In Digital PCR Vol. 1768 (Hrsg. Karlin-Neumann, G. & Bizouarn, F.) (Humana Press, 2018). https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7778-9_2.

Kapitel Google Scholar

Basu, AS Digitale Assays Teil I: Partitionierungsstatistiken und digitale PCR. Slas Technol. 22, 369–386. https://doi.org/10.1177/2472630317705680 (2017).

Artikel Google Scholar

Pekin, D. et al. Quantitativer und empfindlicher Nachweis seltener Mutationen mittels tröpfchenbasierter Mikrofluidik. Lab Chip 11, 2156–2166 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Ling, SD, Geng, Y., Chen, A., Du, Y. & Xu, J. Verbesserte Einzelzellverkapselung in mikrofluidischen Geräten: Von der Tröpfchenerzeugung bis zur Einzelzellanalyse. Biomicrofluidics 14, 061508. https://doi.org/10.1063/5.0018785 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Joensson, HN & AnderssonSvahn, H. Tröpfchen-Mikrofluidik: Ein Werkzeug für die Einzelzellanalyse. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 12176–12192 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Kaminski, TS, Scheler, O. & Garstecki, P. Tröpfchen-Mikrofluidik für die Mikrobiologie: Techniken, Anwendungen und Herausforderungen. Lab Chip 16, 2168–2187 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Mazutis, L. et al. Einzelzellanalyse und -sortierung mittels tröpfchenbasierter Mikrofluidik. Nat. Protokoll. 8, 870–891 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Payne, EM, Holland-Moritz, DA, Sun, S. & Kennedy, RT Hochdurchsatz-Screening durch Tröpfchen-Mikrofluidik: Einblick in wichtige Herausforderungen und Zukunftsaussichten. Lab Chip 20, 2247–2262 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Guo, MT, Rotem, A., Heyman, JA & Weitz, DA Tröpfchen-Mikrofluidik für biologische Hochdurchsatztests. Lab Chip 12, 2146–2155 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Zimny, P., Juncker, D. & Reisner, W. Einzelzellverarbeitung mit Hydrogeltröpfchen: DNA-Reinigung, Handhabung, Freisetzung und On-Chip-Linearisierung. Biomicrofluidics 12, 024107. https://doi.org/10.1063/1.5020571 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Hou, X. et al. Zusammenspiel von Materialien und Mikrofluidik. Nat. Rev. Mater. 2, 1–15 (2017).

ADS Google Scholar

Wang, J. et al. Tröpfchenmikrofluidik zur Herstellung von Mikro- und Nanopartikeln. Mikromaschinen 8, 22 (2017).

Artikel Google Scholar

Abalde-Cela, S., Taladriz-Blanco, P., de Oliveira, MG & Abell, C. Tröpfchenmikrofluidik für die hochkontrollierte Synthese verzweigter Goldnanopartikel. Wissenschaft. Rep. 8, 1–6 (2018).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Xu, S. et al. Erzeugung monodisperser Partikel durch Mikrofluidik: Kontrolle über Größe, Form und Zusammensetzung. Angew. Chem. 117, 734–738 (2005).

Artikel ADS Google Scholar

Wang, W., Zhang, M.-J. & Chu, L.-Y. Funktionelle Polymer-Mikropartikel, hergestellt aus kontrollierbaren mikrofluidischen Emulsionen. Acc. Chem. Res. 47, 373–384 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Ding, Y., Howes, PD & de Mello, AJ Jüngste Fortschritte in der Tröpfchen-Mikrofluidik. Anal. Chem. 92, 132–149 (2019).

Artikel Google Scholar

Lashkaripour, A., Rodriguez, C., Ortiz, L. & Densmore, D. Leistungsoptimierung mikrofluidischer strömungsfokussierender Tröpfchengeneratoren. Lab Chip 19, 1041–1053. https://doi.org/10.1039/C8LC01253A (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Liu, Z. et al. Auswirkungen auf die Tröpfchenerzeugung in Mikrofluidikgeräten mit Stufenemulgierung. Chem. Ing. Wissenschaft. 246, 116959. https://doi.org/10.1016/j.ces.2021.116959 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Hatch, AC et al. 1-Millionen-Tröpfchen-Array mit Weitfeld-Fluoreszenzbildgebung für die digitale PCR. Lab Chip 11, 3838–3845 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Schuler, F. et al. Digitale Tröpfchen-PCR auf Datenträger. Lab Chip 16, 208–216 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

O'Neill, PF et al. Fortschritte beim dreidimensionalen Rapid Prototyping mikrofluidischer Geräte für biologische Anwendungen. Biomicrofluidics 8, 052112 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Chen, L. et al. Eine elliptische Pipette erzeugte große Mikrotröpfchen für die visuelle POC-ddPCR-Quantifizierung niedriger Viruslast. Anal. Chem. 93, 6456–6462 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Xu, XN et al. Ein hohes Seitenverhältnis induzierte die spontane Erzeugung monodisperser Picoliter-Tröpfchen für die digitale PCR. Biomicrofluidics 12, 014103. https://doi.org/10.1063/1.5011240 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Elveflow-Paket zur Tröpfchenerzeugung: https://www.elveflow.com/microfluidics-application-packs/microfluidics-packs/easy-droplet-generation/

Zhou, R. & Chang, H.-C. Versagen der Kapillarpenetration von Blutsuspensionen. J. Colloid Interface Sci. 287, 647–656 (2005).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Kalliadasis, S. & Chang, HC Scheinbarer dynamischer Kontaktwinkel eines fortschreitenden Gas-Flüssigkeits-Meniskus. Physik. Flüssigkeiten 6, 12–23 (1994).

Artikel ADS MathSciNet MATH CAS Google Scholar

Barber, RD, Harmer, DW, Coleman, RA & Clark, BJ GAPDH als Haushaltsgen: Analyse der GAPDH-mRNA-Expression in einer Gruppe von 72 menschlichen Geweben. Physiol. Genomics 21, 389–395 (2005).

Artikel CAS Google Scholar

Chapman, JR & Waldenström, J. Unter Bezugnahme auf Referenzgene: Eine systematische Überprüfung endogener Kontrollen in Genexpressionsstudien. PLoS ONE 10, e0141853 (2015).

Artikel Google Scholar

Armbruster, DA & Pry, T. Leerwertgrenze, Nachweisgrenze und Quantifizierungsgrenze. Klin. Biochem. Rev. 29 (Suppl 1), S49–S52 (2008).

Google Scholar

Alteri, C. et al. Nachweis und Quantifizierung von SARS-CoV-2 durch digitale Tröpfchen-PCR in Echtzeit-PCR-negativen Nasopharynxabstrichen von Patienten mit Verdacht auf COVID-19. PLoS ONE 15, e0236311 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Vasudevan, HN et al. Die digitale Tröpfchen-PCR quantifiziert die SARS-CoV-2-Viruslast aus Rohlysat ohne Nukleinsäurereinigung genau. Wissenschaft. Rep. 11, 1–9 (2021).

Artikel Google Scholar

Yang, J., Tu, R., Yuan, H., Wang, Q. & Zhu, L. Jüngste Fortschritte in der Tröpfchen-Mikrofluidik für die Enzym- und Zellfabriktechnik. Krit. Rev. Biotechnol. 41, 1023–1045 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Xu, Z. et al. Photosynthetische Wasserstoffproduktion durch tröpfchenbasierte mikrobielle Mikroreaktoren unter aeroben Bedingungen. Nat. Komm. 11, 1–10 (2020).

Artikel ADS Google Scholar

Ki, S. & Kang, D.-K. Gasübersprechen zwischen PFPE-PEG-PFPE-Triblockcopolymer-Mikrotröpfchen auf Tensidbasis und Überwachung des bakteriellen Gasstoffwechsels mit tröpfchenbasierter Mikrofluidik. Biosensoren 10, 172 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Lowe, KC Perfluorchemische Atemgasträger: Vorteile für Zellkultursysteme. J. Fluorine Chem. 118, 19–26. https://doi.org/10.1016/S0022-1139(02)00200-2 (2002).

Artikel CAS Google Scholar

Holtze, C. et al. Biokompatible Tenside für Wasser-in-Fluorkohlenstoff-Emulsionen. Laborchip 8, 1632–1639. https://doi.org/10.1039/b806706f (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Cui, X. et al. Smartphone-basierte schnelle Quantifizierung lebensfähiger Bakterien durch Einzelzell-Mikrotröpfchen-Trübungsbildgebung. Analyst 143, 3309–3316 (2018).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Jin, X. et al. Strukturierung der inneren Struktur von Einkristallen durch Geleinbau. J. Phys. Chem. C 123, 13147–13153 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Diaz, M. et al. Größenkontrollierte Goldnanopartikel in Polyacrylamid-Mikrogelen. J. Appl. Polym. Wissenschaft. https://doi.org/10.1002/app.43560 (2016).

Artikel Google Scholar

Zhu, Z. & Yang, CJ Hydrogel-Tröpfchen-Mikrofluidik für die Einzelmolekül-/Zellanalyse mit hohem Durchsatz. Acc. Chem. Res. 50, 22–31 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

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Diese Arbeit wurde vom NIH Common Fund über das Büro für strategische Koordination/Büro des NIH-Direktors, 4UH3CA241684-03, unterstützt. Die Autoren würdigen den Kurs zur Instrumentierungsentwicklung, der von Prof. Jeffrey Kantor an der University of Notre Dame angeboten wird.

Abteilung für Chemie- und Biomolekulartechnik, University of Notre Dame, Notre Dame, IN, 46556, USA

Liao Chen, Chenguang Zhang, Vivek Yadav, Angela Wong, Satyajyoti Senapati und Hsueh-Chia Chang

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LC hat die Arbeiten initiiert, entworfen und durchgeführt. H.-CC hat die Arbeit beraten. H.-CC und SS akquirierten die Finanzierung und leiteten das Projekt. CZ beteiligte sich an den 3D-Druckbemühungen und VY half bei der Tröpfchenbildanalyse. AW half als Ingenieurstudent beim Testen der digitalen PCR mit Pipettentröpfchen. LC und H.-CC haben das Papier mit Beiträgen aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Hsueh-Chia Chang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Chen, L., Zhang, C., Yadav, V. et al. Ein selbstgemachtes Pipettentröpfchen-Mikrofluidik-Rapid-Prototyping- und Trainingskit für digitale PCR, Mikroorganismus-/Zellverkapselung und kontrollierte Mikrogelsynthese. Sci Rep 13, 184 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-27470-1

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Eingegangen: 26. Mai 2022

Angenommen: 02. Januar 2023

Veröffentlicht: 05. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27470-1

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